天津市自然科学基金(033609911)
- 作品数：5 被引量：13H指数：2
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- Ad-VEGF_(121)和Ad-VEGF_(165)重组腺病毒的构建和制备被引量：2
- 2008年
- 目的:以pAdEasy-1缺陷性腺病毒系统为载体构建用于实验动物模型基因治疗的Ad-VEGF121和Ad-VEGF165重组腺病毒。方法:采用RT-PCR方法从人心肌组织中扩增获得VEGF121、VEGF165cDNA片段,分别插入pUCm-T载体构成pUC-VEGFs;限制性内切酶SalⅠ、KpnⅠ切下目的基因片段,插入pAdTrack-CMV载体相应的多克隆位点构成pAdTrack-CMV-VEGFs。电转法将被PmeⅠ切成线性的pAdTrack-CMV-VEGFs转入E coli BJ5183,与其中的pAdEasy-1同源重组成pAdEasy-VEGFs。阳离子脂质体法将被PacⅠ线性化的重组子转染293T细胞进行腺病毒包装。转染后7～11d可在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白(GFP)呈彗星状,收集细胞反复冻融获得含重组腺病毒的上清液。感染293T细胞3～4次,待细胞出现细胞病变效应(CPE)时收获腺病毒(Ad-VEGFs),并用CsCl密度梯度超速离心进行纯化。结果:重组腺病毒在电镜下呈多面体,形态完整;Ad-VEGF121和Ad-VEGF165病毒滴度分别达到1.155×1012和1.281 5×1012 V.P/mL。结论:利用pAdEasy-1缺陷性腺病毒系统构建携带目的基因的重组腺病毒方法较简便,易掌握。获得的重组腺病毒纯度高、滴度高,适用于实验动物模型和体外培养细胞的基因治疗。
- 毛用敏李汇赵莉莉宋衍秋崔让庄
- 关键词：血管内皮生长因子类腺病毒科质粒
- 携带人金属蛋白酶组织抑制剂1重组腺病毒的构建及在人脐静脉内皮细胞中的表达被引量：2
- 2013年
- 目的构建携带人金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP1)的重组腺病毒AdV-hTIMP1,感染体外培养的人脐静脉内皮细胞CRL-1730,观察其mRNA表达情况。方法应用AdEasy复制缺陷型腺病毒载体系统在大肠埃希菌BJ5183中通过同源重组构建Ad-hTIMP1和对照Ad-Track。阳离子脂质体法将重组腺病毒转染到人胚胎肾细胞(HEK293T)中进行包装和扩增。纯化后PCR鉴定hTIMP1目的基因,OD260法测定滴度,透射电镜观察腺病毒形态。将人脐静脉内皮细胞CRL-1730分为3组,空白对照组、Track对照组和TIMP1实验组,感染48h后收集细胞,半定量PCR(RT-PCR)法检测内皮细胞中TIMP1mRNA的表达情况。结果重组腺病毒Ad-hTIMP1的滴度为1.9×1012v.p/mL。其感染人脐静脉内皮细胞CRL-1730后,实验组TIMP1mR-NA的表达明显升高(P<0.05)。结论成功构建了携带hTIMP1基因的重组腺病毒Ad-hTIMP1,成功感染了体外培养的人脐静脉内皮细胞CRL-1730,使细胞中hTIMP1过表达,为心血管疾病的基因治疗提供平台。
- 李汇毛用敏赵莉莉崔让庄王佩显
- 关键词：金属蛋白酶组织抑制剂1基因治疗
- Ad-hTIMP1感染对Hcy刺激人脐静脉内皮细胞MMP1、MMP9、TIMP1 mRNA表达的影响
- 2012年
- 目的构建携带人金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP1)的重组腺病毒Ad-人TIMP1(hTIMP1),将其感染用同型半胱氨酸(Hcy)刺激的人脐静脉内皮细胞CRL-1730,观察该细胞基质金属蛋白酶(MMP)1、MMP9、TIMP1mRNA的表达变化。方法在大肠杆菌BJ5183中通过同源重组构建重组腺病毒Ad-hTIMP1和对照重组腺病毒Ad-Track。将CRL-1730细胞分为空白对照组、Track对照组和基因治疗组,并根据加入Hcy浓度的不同各分为三个亚组,即空白对照组、生理浓度组和病理浓度组。病毒感染48 h后加入Hcy刺激,6 h后收集各组CRL-1730细胞,RT-PCR法检测CRL-1730细胞中的MMP1、MMP9、TIMP1 mRNA。结果 Ad-hTIMP1和Ad-Track的滴度分别为1.9×1012VP/mL和0.6×1012VP/mL。基因治疗组Ad-hTIMP1感染CRL-1730细胞后,该细胞的TIMP1mRNA表达明显高于空白对照组(P<0.05),即使加入病理浓度的Hcy,CRL-1730细胞中TIMP1mRNA的表达仍处于高水平,而MMP1、MMP9 mRNA的表达明显降低(P均<0.05)。结论成功构建了Ad-hTIMP1和Ad-Track。重组腺病毒Ad-hTIMP1感染CRL-1730细胞后,该细胞中TIMP1 mRNA过表达,可抑制高浓度Hcy刺激造成的MMP1、MMP9mRNA的表达升高,提示其可对抗Hcy对内皮细胞的损伤。
- 李汇毛用敏赵莉莉崔让庄王佩显
- 关键词：金属蛋白酶组织抑制剂基因疗法
- 高浓度Hcy致血管内皮损伤的机制被引量：5
- 2009年
- 目的:探讨高浓度同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)CRL-1730一氧化氮合酶(eNOS)mRNA表达的影响。方法:用不同浓度Hcy(0～5.0mmol/L)刺激HUVEC CRL-1730,分别作用1～24h,收集细胞,提取总RNA,逆转录得到cDNA,PCR扩增eNOS基因片段,2%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物,计算相对含量。结果:随着Hcy浓度增高HUVEC CRL-1730eNOS mRNA表达逐渐降低;随着Hcy作用时间的延长,HUVEC CRL-1730eNOS mRNA表达降低。病理浓度(0.1mmol/L)及毒性药理浓度(5.0mmol/L)Hcy与生理浓度Hcy(0.01mmol/L)相比可显著降低HUVEC CRL-1730eNOS mRNA的表达。结论:高浓度Hcy可能通过降低eNOS水平,减少NO合成,导致血管内皮功能损伤。
- 宋衍秋赵莉莉李汇毛用敏崔让庄
- 关键词：半胱氨酸一氧化氮合酶聚合酶链反应
- 同型半胱氨酸对人脐静脉内皮细胞MCP-1 mRNA表达的影响被引量：4
- 2009年
- 目的:探讨同型半胱氨酸(Hcy)对人脐静脉内皮细胞单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)mRNA表达的影响。方法:人脐静脉内皮细胞CRL-1730融合至90%分别加入不同浓度Hcy:空白组0mmol/L、生理剂量组0.01mmol/L、病理剂量组0.1mmol/L、非毒性药理剂量组1.0mmol/L。毒性药理剂量组5.0mmol/L,分别刺激细胞6h,用1.0mmol/LHcy刺激内皮细胞1、6、24h;收集细胞提取总RNA,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定Hcy对MCP-1mRNA的表达情况。结果:不同浓度Hcy刺激CRL-17306h,细胞内MCP-1mRNA表达差异有统计学意义(P<0.05)。与生理剂量组相比,非毒性药理剂量组MCP-1mRNA表达升高,毒性药理剂量组表达降低;1.0mmol/LHcy刺激CRL-1730不同时间后,MCP-1mRNA表达随刺激时间延长呈逐渐降低的趋势,24h表达量最低(P<0.01)。结论:Hcy可以影响人脐静脉内皮细胞MCP-1mRNA的表达,在动脉粥样硬化的发生过程中发挥重要的作用。
- 赵莉莉李汇宋衍秋毛用敏崔让庄
- 关键词：单核细胞化学吸引蛋白质类脐静脉内皮逆转录聚合酶链反应
