国家自然科学基金(30070210)
- 作品数：11 被引量：11H指数：3
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- 人补体衰变加速因子、补体膜辅助调节蛋白及CD59真核表达载体构建及序列分析
- 2006年
- 目的:构建人补体衰变加速因子(Decayacceleratingfactor,DAF)、补体膜辅助调节蛋白(membranecofactorprotein,MCP)、CD59的真核表达载体pSecTag2/HygroB-DAF、pSecTag2/HygroB-MCP、pSecTag2/HygroB-CD59。方法:应用PCR方法,从DAF-pGEM-TEasyVector、MCP-pGEM-TEasyVector和CD59-pGEM-TEasyVector分别克隆所需的DNA片段,经限制性内切酶BglandXhol消化后,插入到具有相应酶切位点的真核表达载体pSecTag2/HygroB中,分别构建人DAF、MCP、CD59真核表达质粒,并进行酶切鉴定及DNA序列测定分析。结果:DAF基因大小为1049bp,MCP基因大小为1065bp,CD59基因大小为312bp,与genbank中记载的人DAF、MCP和CD59cDNA序列结果基本相同。结论:成功构建DAF、MCP和CD59真核表达质粒,为今后进一步探讨及研究转基因肝脏奠定了基础。
- 乔庆窦科峰陈勇张静李剑平毛海泉
- 关键词：基因真核表达
- 可溶性成纤维细胞生长因子受体基因转染在抑制慢性排斥所致血管病变中的作用被引量：1
- 2003年
- 目的 通过阻断成纤维细胞生长因子 (FGF)作用 ,抑制慢性排斥反应所致血管内膜增生 (AGA)。方法 通过克隆并构建可溶性FGF受体sFGFR 1、cDNA质粒构建腺病毒Adv5 sFGFR 1,转基因载体。体外检测sFGFR 1及FGF 2对STS培养的成纤维细胞增殖抑制作用。采用大鼠腹主动脉转染 5× 10 9pfuAv3 sFGFR 1,分别用等量Av3 Nall及生理盐水做实验及空白对照组。将转染后DA大鼠腹主动脉长约 1 5cm ,原位移植于PVG大鼠体内。于移植后分批定期活杀大鼠 ,取移植腹主动脉进行组织形态学、免疫组化、RT PCR检查 ,观察sFGFR 1表达以及AGA改变。结果 ( 1)构建sFGFR 1、cDNA质粒可以在大鼠血管内皮细胞获得稳定表达。其分泌型sFGFR 1蛋白可与FGF 2交联并有效抑制FGF 2刺激的培养成纤维细胞的增殖。 ( 2 )体内主动脉移植实验结果显示与空病毒Av3 Nall及生理盐水对照 ,Adv 3 sFGFR 1转染主动脉通过免疫组化及RT PCR显示sFGFR 1基因表达及蛋白分泌。至移植后 90d实验组sFGFR 1转染显著抑制移植主动脉AGA(P =0 0 13)。结论FGF在慢性排斥所致血管病变AGA中具有重要作用。通过sFGFR 1阻断FGF可显著抑制慢性排斥反应所致AGA。
- 陈勇崔大祥杨雁灵戴辉
- 关键词：基因转染慢性排斥血管病变
- 构建人补体衰变加速因子真核载体并转染NIH/3T3成纤维细胞被引量：3
- 2006年
- 目的:构建人补体衰变加速因子(DAF)真核表达载体pSecTag2/HygroBDAF,并利用壳聚糖组装成纳米微粒复合体,转染小鼠NIH/3T3成纤维细胞。方法:应用PCR方法,从DAFpGEMTEasyVector克隆相关的DNA序列,插入具有相应酶切位点的真核表达载体pSecTag2/HygroB中,构建pSecTag2/HygroBDAF真核表达质粒,并进行酶切鉴定及序列测定;利用壳聚糖包裹质粒,转染小鼠NIH/3T3细胞,并对转染细胞用抗DAF进行免疫组化染色。结果:DAF基因大小为1049bp,与基因序列数据库中记载的人DAFcDNA序列结果完全一致;利用壳聚糖DAF纳米微粒转染NIH/3T3细胞24h后,免疫组化染色显示细胞质弥漫染色阳性。结论:成功构建了人DAF真核表达载体并通过壳聚糖介导转染NIH/3T3细胞。
- 乔庆陈勇窦科峰张静李剑平
- 关键词：壳聚糖纳米微粒基因克隆基因转染
- 大鼠sFGFR1转基因腹主动脉移植模型建立
- 2003年
- 目的 :建立一种稳定的大鼠sFGFR1转基因腹主动脉移植模型 .为通过基因转染研究慢性排斥反应所致移植器官内动脉血管进行性硬化 (AGA)的病变机制及治疗提供实验手段 .方法 :克隆sFGFR1基因 ,并在RTS系统中高效表达相应蛋白 ,构建Adv5 sFGFR1及Adv5 LacZ转基因载体 .供体大鼠经左肾动脉插管 ,分别灌注Adv5 LacZ及Adv5 sFGFR1 2×1 0 9～ 5× 1 0 9Pfu约 1 0 0～ 2 0 0 μL .在主动脉充满灌注液后 ,保持压力 2 0min .结扎左肾动脉 ,切取该段腹主动脉 .原位移植于受体大鼠腹腔内 .于移植后 1 ,3,7,1 4和 2 8d ,分批活杀受体大鼠 ,切取移植主动脉 ,行组织形态学及 β gal染色检查形态学改变LacZ基因表达 ,及免疫组化染色 ,RT PCR检查 ,观察sFGFR1表达 .结果 :采用阻断腹主动脉 ,恒压灌注法于转染移植后 3,7,1 4和 2 8d,免疫组化染色 ,RT PCR检查及β gal染色法可检测到Adv5 LacZ和sFGFR1基因在主动脉血管内皮细胞及间质平滑肌细胞中均有高效表达 .目标基因表达随时间延长有减弱趋势 .组织形态学检查证明转基因主动脉在形态及结构保持正常、完整、无炎症反应等破坏表现 .结论 :通过阻断血管 ,恒压灌注 ,可成功将目标基因 (LacZ ,sFGFR1 )转染大鼠主动脉 .移植后目标基因可获得安全。
- 陈勇杨雁灵崔大祥
- 关键词：动物模型转基因
- 构建人CD59真核表达载体并利用壳聚糖介导转染NIH3T3细胞
- 2006年
- 目的构建人CD59真核表达载体pSecTag2/HygroB-CD59,并利用壳聚糖(chitosan)组装成纳米微粒复合体,转染小鼠NI H3T3细胞。方法应用PCR方法,从CD59-pGEM-T Easy Vector克隆相关的DNA序列,插入到具有相应酶切位点的真核表达载体pSecTag2/HygroB中,构建pSecTag2/HygroB-CD59真核表达质粒,并进行酶切鉴定及序列测定。利用壳聚糖包裹质粒,转染小鼠NI H3T3细胞,并用抗CD59抗体对转染细胞进行免疫组织化学染色。结果CD59基因大小为312bp,与Genbank中记载的人CD59cDNA序列结果完全一致。利用壳聚糖-CD59纳米微粒转染NI H3T3细胞24h后,免疫组织化学染色显示转染细胞CD59呈弥漫性胞浆阳性。结论成功构建了人CD59真核表达载体并通过壳聚糖介导转染NI H3T3细胞,为进一步探讨及研究转基因肝脏奠定了基础。
- 乔庆窦科峰陈勇张静李剑平王映梅毛海泉
- 关键词：CD59壳聚糖纳米微粒基因转染
- sFGFR1基因的克隆与在RTS系统中的高效表达被引量：3
- 2003年
- 目的 :克隆sFGFR1(solublefibroblastgrowthfactorsre ceptor 1)基因 ,并在RTS(rapidtranslationsystem)系统中高效表达相应蛋白 .方法 :培养Swissrat 3T3fibroblast细胞株 ,提取总RNA ,用RT PCR方法获取鼠sFGFR1cDNA片段 ,酶切后克隆到pIVEX2 .3d载体并进行序列分析 ;采用RocheRTSProtein Master 5 0 0系统 ,高效表达sFGFR1蛋白并用WesternBlot鉴定表达的蛋白 .结果 :克隆了sFGFR1基因 ,测序证实序列正确 ;WesternBlot证实sFGFR1蛋白在RTS系统中高效表达 .结论
- 陈勇崔大祥孙凯杨雁灵戴辉
- 关键词：受体成纤维细胞生长因子克隆分子RTS
- 构建人补体膜辅助调节蛋白真核表达载体并通过壳聚糖介导转染NIH 3T_3细胞
- 2006年
- 目的:构建人补体膜辅助调节蛋白(m embrane cofactor prote in,MCP)真核表达载体并利用壳聚糖(Ch itosan)转染小鼠NIH3T3细胞。方法:应用PCR方法,从MCP-pGEM-T Easy Vector克隆相关的DNA序列,插入到具有相应酶切位点的真核表达载体pSecTag2/HygroB中,构建pSecTag2/HygroB-MCP真核表达质粒,并进行酶切鉴定及序列测定;利用壳聚糖包裹质粒,转染小鼠NIH 3T3细胞,并对转染细胞进行抗MCP免疫组织化学染色。结果:MCP基因大小为1 065 bp,与Genebank中记载的人MCP cDNA序列结果基本一致;抗MCP免疫组织化学染色显示转染细胞胞浆弥漫阳性。结论:成功构建了人MCP真核表达载体并通过壳聚糖介导转染NIH3T3细胞,为进一步探讨及研究转基因肝脏奠定了基础。
- 乔庆陈勇窦科峰张静张传山
- 关键词：分子生物学壳聚糖纳米微粒免疫组织化学
- Fas介导细胞凋亡通路在慢性排斥反应所致移植物血管病变中的作用被引量：4
- 2003年
- 目的 通过建立小鼠心脏及主动脉移植模型探讨Fas途径介导细胞凋亡在慢性排斥反应所致移植物血管病变形成中的作用。方法 (1)正常B6及B6.MRL(Fas -/-)→B10 .2R小鼠腹腔异位心脏移植。B10 .2R→B6小鼠胸主动脉异位移植。定期获取移植物。观察移植物存活率与组织形态学改变 ;TUNEL及FITC AnnexinV /PI双染色方法检测移植物中凋亡细胞形态及分布 ;B6小鼠主动脉体外培养。人重组的可溶性FasL诱导平滑肌细胞凋亡。结果 B6.MRL(Fas-/-)供体来源移植物存活期显著延长 ,其血管平滑肌细胞凋亡明显减少。新生血管内膜中的平滑肌细胞具有抗Fas介导凋亡的特性。
- 陈勇崔大祥孙凯杨雁灵戴辉
- 关键词：慢性排斥反应移植物血管病变FAS介导细胞凋亡通路脱噬作用
- 转染肝细胞生长因子基因对CCl_4损伤人肝细胞株的保护作用
- 2004年
- 何勇周峻窦科峰陈勇
- 关键词：肝细胞株四氯化碳
- 可溶性成纤维细胞生长因子受体-1基因的克隆和在快速翻译系统中高效表达对成纤维细胞增殖抑制作用
- 2004年
- 目的 克隆可溶性成纤维细胞生长因子受体 1(sFGFR 1)基因 ,并在快速翻译系统(RTS)中高效表达相应蛋白。方法 培养SwissRat 3T3成纤维细胞株 ,提取总RNA ,用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)方法获取鼠sFGFR 1cDNA片段 ,酶切后克隆到 pIVEX2 .3d载体并进行序列分析 ;采用RocheRTSProteinMaster 5 0 0系统 ,高效表达sFGFR 1蛋白并用Westernblot鉴定表达的蛋白。体外转染大鼠血管内皮细胞。收集培养液上清 ,检测sFGFR 1及成纤维细胞生长因子 2 (FGF 2 )对成纤维细胞增殖抑制作用。结果 克隆了sFGFR 1基因 ,测序证实序列正确 ;Westernblot证实sFGFR 1蛋白在RTS系统中高效表达。FGF 2对STS成纤维细胞增殖具有明显抑制作用。结论 克隆sFGFR 1基因在RTS系统获得高效表达。对 3T3成纤维细胞具有明显增殖抑制作用。
- 陈勇杨雁灵李纪鹏崔大祥
- 关键词：克隆成纤维细胞增殖基因表达器官移植
