江苏省科技厅基金(BS2004021)
- 作品数：10 被引量：14H指数：2
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- 标准菌株和临床菌株oipA基因的检测及其核苷酸序列比对被引量：1
- 2007年
- 目的:检测幽门螺杆菌标准菌株NCTC11637及临床分离菌株Hp1和Hp2的oipA基因,分析其核苷酸序列,比对其与国际标准菌株Hp26695的同源性。方法:常规方法培养幽门螺杆菌,提取DNA,PCR法扩增oipA基因,检测其核苷酸序列,并比较其与Hp26695的同源性。结果:NCTC11637及Hp1、Hp2均表达oipA基因。其核苷酸序列与Hp26695比对,NCTC11637有48个突变位点、Hp1有48个突变位点、Hp2有50个突变位点,同源性均为94%。NCTC11637与Hp1的同源性为100%、与Hp2的同源性为97%。结论:NCTC11637、Hp1、Hp2均表达oipA基因,但不同菌株oipA基因的核苷酸序列有所不同。
- 邵世和王华刘木清韩晓红段秀杰
- 关键词：幽门螺杆菌
- 幽门螺杆菌47kDa微孔蛋白基因的克隆表达及特性鉴定
- 2007年
- 目的对人幽门螺杆菌（H．pylori）编码47kDa外膜微孔蛋白基因omp47克隆表达及特性鉴定，探索研制H．pylori疫苗的新途径。方法培养和收集H．pylori标准菌株NTTCll637及临床菌株，采用酚：氯仿抽提、纯化基因组DNA。设计上下游引物，并以该基因组为模板，采用聚合酶链反应（PCR）扩增omp47基因片断。将目的基因和与克隆载体PGEM-T连接后，转化至EcoliDH5a及BL21，碱裂解提取质粒经BamHl和Xhol双酶切鉴定并进行序列分析。重组蛋白采用IPTG诱导表达后，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）鉴定、镍亲和层析纯化检测抗原活性。结果经酶切、测序分析表明，插入的基因片断为1284bp，编码427个氨基酸。与GenBank公布的H．pylori标准株26695、43504及J99序列比对，核苷酸同源性高达94%～96％，编码氨基酸同源性96%～99%。经SDS-PAGE检测，电泳图谱上显示一条相对分子量为47kda的新生蛋白带。Westernblot检测表明重组蛋白有较好的抗原性。结论成功克隆了外膜微孔蛋白OMP47的编码基因，为H．pylori疫苗的研制和试剂盒的开发奠定了良好的基础。
- 郝渭滨邵世和鞠小丽李良菊王华
- 关键词：幽门螺杆菌蛋白纯化
- 幽门螺杆菌外膜蛋白hopX基因克隆表达及生物信息学分析
- 2008年
- 目的：构建幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）hopX外膜蛋白编码基因的重组质粒,并进行生物信息学分析,探索筛选Hp疫苗的新途径。方法：应用PCR技术从Hp基因组扩增hopX外膜蛋白编码基因片段,TA克隆后测序分析,用信息学软件分析其物理化学特性,并构建表达载体hopX-pQE30转化E.coliM15,IPTG诱导表达,SDS-PAGE及Western blot鉴定表达蛋白。结果：测序分析表明hopX基因全长为1284bp,与Gene Bank公布的其他Hp菌株的基因序列同源性为96%～97%,氨基酸同源性为97%～99%,软件预测显示有多个明显的具有抗原活性的结构域。SDS-PAGE检测表明,47kD处有一新生的蛋白带,Western blot检测重组蛋白具有良好的抗原活性。结论：首次获得HpNCTC11637菌株hopX基因,其表达产物为外膜蛋白生物学功能和疫苗的研究奠定了基础。
- 鞠小丽邵世和郝渭滨
- 关键词：幽门螺杆菌生物信息学分析
- 幽门螺杆菌cag PAI编码的Ⅳ型分泌系统被引量：8
- 2007年
- 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)是定植于人胃部特定的病原菌,感染呈全球分布,感染率高达50%以上。现已证实它是轻度胃炎,消化性溃疡及胃癌的主要病因。Ⅰ型H.pylori菌株含有一个约40kb的特殊基因片段,即cag致病岛(cytotoxin associated gene pathogenicity island,cag PAI),该片段只出现于致病相关菌株,基因呈高密度分布并编码一个分泌转运系统称为Ⅳ型分泌系统(type Ⅳ secretion system,TFSS),通过转运相关毒素而参与H.pylori诱导上皮细胞细胞内的酪氨酸磷酸化、细胞骨架重排、基垫结构形成、活化核转录因子NF-κB、诱导促炎细胞因子白细胞介素-8的表达等,故在H.pylori的致病中起着关键作用。近年来,研究者们致力于研究Ⅳ型分泌系统的功能,但是对于这个装置是如何转运蛋白进入宿主细胞的确切机制还是知之甚少,因此,对Ⅳ型分泌系统的研究将有助于进一步明确H.pylori致病机制,并为临床诊断和治疗提供新的靶点。
- 崔蕾蕾邵世和
- 关键词：幽门螺杆菌CAGPAI
- 幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统HP0527-C基因的克隆表达及其生物学功能的初步研究被引量：1
- 2008年
- 为克隆表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)NCTC 11637 hp0527-c基因,探讨其生物学功能。设计引物扩增,T-A克隆,测序正确后构建表达载体pET-28a-hp0527-c,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达后以Ni2+-NTA柱获得纯度为98%重组蛋白。经Western blot鉴定正确后,免疫新西兰大白兔获得了较高滴度的多克隆抗体;将重组蛋白作用于BGC-823细胞,RT-PCR检测细胞IL-8mRNA表达增高;同时用MTT法来检测重组蛋白对细胞增殖的影响,结果表明其活性呈现一定量的时间和剂量依赖性。已成功克隆了HP0527-C的重组蛋白,初步探讨了其与细胞之间的相互作用,为进一步阐明H.pylori致病机制奠定了基础。
- 母润红邵世和马方王华崔蕾蕾钟桥鞠小丽董苏荣
- 关键词：幽门螺杆菌克隆表达细胞因子细胞增殖
- 幽门螺杆菌Cag-PAI hp0525基因的克隆表达及其重组蛋白HP0525对SGC-7901细胞增殖的影响
- 2009年
- 目的：由于文献报道幽门螺杆菌（Helicobacter priori）是产生胃溃疡和胃癌的致病菌之一，一个重要的影响因素是由cag致病岛编码的四型分泌系统。Hp0525是Cag致病岛中重要成分，是一种内膜蛋白ATPase。而幽门螺杆菌中Cag蛋白的表达以及Cag PAI编码的各自蛋白功能研究得还很少，为进一步研究幽门螺杆菌的致病机制和研发幽门螺杆菌诊断试剂盒及疫苗，特克隆幽门螺杆菌NCTC 11637hp0525（caga）基因，并对其进行测序，构建原核重组质粒，表达HP0525蛋白，初步研究其对SGC-7901细胞增殖的影响。方法：应用PCR技术从H.pylori基因组DNA中扩增hp0525编码基因片段，克隆至pMD18-T载体后，再将其定向插入pET-30a载体中，双酶切鉴定筛选阳性克隆，以DNA自动分析仪进行序列测定。测序分析正确后，经IPTG诱导表达，表达蛋白以Ni^2＋-NTA柱进行纯化，并经Western blot和MALDI-TOF鉴定，透析除盐后的蛋白，通过免疫新西兰大白兔和抗体效价的测定，纯化的蛋白作用于SGC-7901细胞，用MTT法检测蛋白对细胞增殖的影响。结果：成功克隆hp0525基因，全长993bp，编码330个氨基酸，与GenBank公布的其他H.pylori菌株基因序列的核苷酸同源性为97％-99％。工程菌诱导后SDS-PAGE显示新生表达蛋白带，相对分子质量为36000，与预期一致，经Ni^2＋-NTA柱纯化后可获得纯度为98％重组蛋白。蛋白作用于SGC-7901细胞后，结果呈现一定量的时间和剂量依赖性。它是一种ATPase，通过测定具有一定的活性。活性为4．40IU／ml结论：成功克隆hp0525基因，并在大肠杆菌BL21中表达，经过镍柱纯化后得到纯度较高的蛋白，MTT法来检测出重组蛋白抑制细胞增殖；同时具有一定的酶活力，为进一步研究其生物学功能奠定了基础。
- 母润红邵世和钟桥崔蕾蕾张成义
- 关键词：幽门螺杆菌克隆增殖
- 幽门螺杆菌外膜36kDa蛋白重组表达、纯化及初步鉴定
- 2008年
- [目的]构建幽门螺杆菌(H.pylori)NCTC11637菌株36kDa(OMP36)外膜蛋白基因原核表达系统,探索研制H.pylori疫苗的新途径。[方法]培养和收集H.pylori NCTC11637菌株,提取基因组DNA,PCR扩增目的基因片断。将其克隆到T载体并测序,再将目的基因克隆入PET32a(+),构建重组表达载体PET32a-OMP36。转化E.coliBL21后IPTG诱导表达,经SDS-PAGE鉴定、镍亲和层析纯化、Western blot检测表达蛋白。[结果]测序分析表明,插入的基因片断为987bp,表达的蛋白的相对分子质量(M r)约为36kDa,并显示具有良好的抗原性。SDS-PAGE检测表明,表达量占细菌总蛋白的37%,镍亲和层析纯化率约92%。Western blot检测表达蛋白具有良好的抗原活性。[结论]成功克隆了外膜蛋白OMP 36kDa的编码基因,其表达产物OMP36有望成为新的Hp疫苗候选分子,为H.py-lori疫苗的研制和试剂盒的开发奠定了良好的基础。
- 鞠小丽邵世和郝渭滨董苏荣崔蕾蕾
- 关键词：幽门螺杆菌外膜蛋白基因表达蛋白纯化
- 幽门螺杆菌cag7-n基因克隆表达及其重组蛋白对BGC-823细胞生物学的影响被引量：1
- 2014年
- 目的研究克隆幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)cag7-n基因对BGC-823细胞增殖和IL-8分泌的影响.方法采用PCR技术从H.pylori基因组DNA中扩增cag7-n基因片段,构建重组质粒pET-28a-cag7-n,转化大肠杆菌BL21,经Western blot鉴定,纯化的蛋白作用于BGC-823细胞,用MTT法检测蛋白对细胞增殖的影响.结果成功克隆cag7-n基因,经镍柱纯化后可获得纯度为98%的重组蛋白.纯化蛋白浓度在100,150,200μg/mL时,培养时间延长,细胞的增殖受到抑制;在相同的培养时间,细胞的增殖程度随蛋白浓度的增加而降低.结论成功克隆了cag7-n基因,并在大肠杆菌BL21中表达,经过镍柱纯化后得到纯度较高的蛋白,纯化透析后的蛋白与BGC-823细胞共培养,可诱导细胞因子IL-8在mRNA水平上的表达及其对BGC-823细胞增殖的影响.
- 周海星母润红
- 关键词：幽门螺杆菌
- 幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统cagT基因的克隆表达及其重组蛋白对SGC-7901细胞增殖和分泌细胞因子功能的影响被引量：3
- 2008年
- 【目的】初步研究幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，H．pylori）NCTC 11637 cagT（HP0532）基因对SGC-7901细胞增殖和白细胞介素-8（IL-8）分泌的影响。【方法】应用PCR技术从H．pylori基因组DNA中扩增cagT编码基因片段，将其定向插入pQE30载体中，双酶切鉴定筛选阳性克隆。测序分析确认后，IPTG诱导表达，表达蛋白以Ni^2＋-NTA柱进行纯化，并经Western blot鉴定，纯化的蛋白作用于SGC-7901细胞，提取细胞总RNA，RT-PCR扩增IL-8，并用MTT法检测蛋白对细胞增殖的影响。【结果】成功克隆了cagT基因，全长843bp（GenBank登录号为EF114758），编码280个氨基酸，与GenBank公布的其他H．pylori菌株基因序列的核苷酸同源性为97％-99％。工程菌诱导后SDS-PAGE显示新生表达蛋白带，相对分子质量约为32kDa，经Ni^2＋-NTA柱纯化后可获得纯度为98％重组蛋白。经透析复性后的蛋白（终浓度10μg／mL）作用于SGC-7901细胞后，可诱导细胞因子IL-8在mRNA水平上的表达。不同浓度CagT蛋白与SGC-7901细胞作用，细胞增殖的程度随着蛋白浓度的增加逐渐降低，细胞的增殖受到抑制。【结论】CagT蛋白可刺激SGC-7901细胞IL-8的表达，并抑制细胞增殖，为进一步研究其生物学功能奠定了基础。
- 崔蕾蕾邵世和李良菊王华母润红鞠小丽董苏荣钟桥
- 关键词：幽门螺杆菌白细胞介素-8
- NCTC11637外膜蛋白36ku基因的克隆及序列分析
- 2007年
- 目的:对人幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)36ku(OMP36)外膜蛋白进行基因克隆表达,探索研制H.pylori疫苗的新途径。方法:培养H.pylori菌株NCTC11637,采用酚:氯仿抽提和纯化基因组DNA。设计上下游引物,并以该基因组为模板,采用聚合酶链反应(PCR)扩增目的基因片断。将目的基因和PET32a(+)同时经HindⅢ和KpnⅠ双酶切,纯化,连接后,转化含有目的基因的重组载体,酶切鉴定后进行序列分析。结果:经酶切,测序分析表明,插入的基因片断为987bp,与GenBank公布的H.pylori 26695、ATCC43504及J99序列相比较,同源性高达94%-96%,推测的氨基酸序列同源性为97%-99%,GenBank登录号059968。结论:成功克隆了H.pylori 36ku的外膜蛋白的编码基因,其表达产物OMP36有望成为新的Hp疫苗候选分子,为H.pylori疫苗的研制和试剂盒的开发奠定了基础。
- 郝渭滨邵世和王华鞠小丽
- 关键词：幽门螺杆菌原核表达载体基因克隆
