辽宁省自然科学基金(20102009)
- 作品数：12 被引量：44H指数：5
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- 相关领域：生物学轻工技术与工程农业科学更多>>
- 中国明对虾溶菌酶点突变基因的原核表达
- 2014年
- 为解决中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)溶菌酶成熟肽(FcLys)可溶性问题,构建了点突变基因的原核表达质粒,并进行重组表达。以已构建的带有FcLys目的基因的重组克隆质粒为模板扩增FcLys点突变(FcLysM)的基因片段,将该对虾溶菌酶成熟肽序列的N端和C端中含有几个疏水性氨基酸经点突变改为亲水性氨基酸,但不改变其活性中心和二硫键的形成。将FcLysM的基因片段与表达载体连接并转化,制得基因工程菌pET-39b(+)-FcLysM/Rosetta(DE3)。通过基因测序方法验证该重组表达质粒读码框的准确性以及FcLysM目的基因序列的正确性。该工程菌表达后在SDS-PAGE结果显示,表达产物为分子质量约为43ku的融合蛋白FcLysM。进一步研究分析证明,该重组点突变蛋白的可溶性表达量高于非突变的对虾溶菌酶表达量。
- 谭广毅丛丽娜姜启晨卢冬
- 关键词：原核表达
- 产碱性蛋白酶海洋细菌的筛选及其发酵条件优化被引量：3
- 2013年
- 从大连海域的海参肠道中筛选得到一株产碱性蛋白酶较高的海洋细菌HS-A156，经形态学和16SrDNA序列分析初步鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）（GenBank检索号KCl66863）。对菌株HS-A156的酶学性质进行初步研究，结果表明该菌株所产蛋白酶最适作用pH为9．0，在pH8．O～11．0性能稳定；最适作用温度为40℃，在25～45℃具有良好的热稳定性。同时对该菌株产酶发酵培养基和发酵条件进行优化，确定了最适产酶培养基组成为葡萄糖1．5％、牛肉膏1．0％、酵母粉2．0％、CaCl20．05％；最佳发酵条件培养基初始pH8．0、发酵温度30℃、接种量3％。经过优化后菌株HS-A156产碱性蛋白酶的酶活力达到538U／mL，比优化前的产酶量提高了3．7倍。
- 宋明徽丛丽娜王红英姜启晨
- 关键词：海洋细菌碱性蛋白酶发酵优化
- 重组海参溶菌酶N端可溶性表达与抑菌分析
- 2013年
- 通过对海参(Stichopus japonicus)溶菌酶(SjLys)cDNA(Genbank accession no:EF036468)片段的分析,结果发现N端基因区域所对应的蛋白质序列中含有糖苷酶活性。因此利用RT-PCR技术以其为模板,扩增出长度为174 bp的溶菌酶N端(SjLys-N)基因,将其亚克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32a(+)-SjLys-N,再转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)pLysS,成功地构建了重组SjLys-N的基因工程菌。该工程菌在改造的LB培养基和最适的发酵条件下经IPTG诱导后,表达约23 kD的重组SjLys-N蛋白。此外,它还能以可溶性的形式表达,占总菌体蛋白约46%。经过Western blotting分析,重组SjLys-N在23 kD左右能够与penta-his抗体发生特异性免疫反应,结果表明重组SjLys-N得到正确的表达。最后对纯化后的重组SjLys-N进行了抑菌特性的分析,结果发现它对溶壁微球菌和副溶血弧菌有较高的抑菌活性。上述结果将为进一步研究海参溶菌酶的基因结构与功能之间的关系提高参考。
- 常艺海丛丽娜栾桂花刘志文杨杰钱斯日古楞
- 关键词：可溶性表达抑菌活性
- 重组中国明对虾溶菌酶包涵体的复性研究被引量：1
- 2014年
- 作者的前期研究已证明,大肠杆菌表达系统能够高效表达重组中国明对虾溶菌酶,但目的蛋白主要以包涵体形式存在。本实验研究了重组中国明对虾溶菌酶包涵体的变性条件,并分别采用稀释复性法和亲和层析复性法对包涵体进行处理。实验结果发现,亲和层析复性明显优于稀释复性,具有更高的蛋白复性产率。在亲和层析复性实验中,分别优化了上样量、pH和温度3种因素。结果表明,较低浓度的蛋白复性液在pH 8.0的缓冲体系下,降低上样量并提高环境温度,会有效提高复性效率。亲和层析复性得到高纯度、可溶的重组对虾溶菌酶蛋白对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和溶壁微球菌均具有高效的抑菌活性。
- 张艳敏李成武瑶梁雯靖宋宛霖姚鹏丛丽娜刘志文
- 关键词：溶菌酶包涵体重组蛋白复性
- 枯草芽孢杆菌发酵条件的优化及微生态制剂的研制被引量：9
- 2013年
- 以从海参肠道中筛选的枯草芽孢杆菌为发酵菌株，通过单因素实验和正交实验确定了发酵培养基的最佳成分，即葡萄糖1.0％、牛肉膏1.5％、K2HPO40.5％；最适发酵条件为发酵温度30℃，初始pH7.2，接种量4％，发酵时间38～40h。经过优化后发酵液的活茵浓度可达到3.98×10^9 cfu／mL。再以1％海藻酸钠为壁材，4％氯化钙作为固化剂，将发酵后收集的菌体通过乳化法和挤压法制成微胶囊制剂，采用活菌计数法进行该微胶囊制剂的稳定性实验。结果显示，分别采用乳化法和挤压法包埋制备的微胶囊制剂的活菌存活率均高于未经微胶囊化的样品，但乳化法制备工艺相对较为简单且微胶囊形成速度较快，因此预计乳化法将更适合于该菌株微生态制剂的大规模工业化生产。
- 宋文龙丛丽娜王红英
- 关键词：枯草芽孢杆菌正交实验微生态制剂
- 海洋枯草芽孢杆菌HS-A38产直链脂肽活性物质的初步检测被引量：6
- 2011年
- 从海参肠道中分离得到了一株海洋枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HS-A38,将其发酵上清液经盐酸沉淀、有机溶剂萃取得到具有广谱抗菌活性的代谢物质。采用薄层层析和茚三酮显色检测到4种物质,分别命名为化合物1、2、3和4;应用层析板覆盖指示菌的生物自显影技术对其抗菌活性成分进行追踪、检测,结果发现化合物1和2具有显著抑制弧菌的作用。进一步检测分析表明,化合物1、2和4具有很强的热稳定性,初步推断它们属于直链的脂肽类化合物,并且这4种物质出现在不同的发酵代谢时期,这将为研究群体效应提供基础检测依据。
- 张欢丛丽娜侯英敏李爱民谢三群王丹
- 关键词：抗菌活性
- 海参溶菌酶枯草芽孢杆菌基因工程菌构建
- 2014年
- 通过基因重组等技术构建重组海参溶菌酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌,并对此基因工程菌进行生长曲线的测定和稳定性分析。结果表明,海参溶菌酶基因特异引物在400 bp处扩增出特异性条带,与预期的海参溶菌酶基因大小一致;重组表达质粒pHT43-SjLys经双酶切验证得8 000 bp和400 bp左右的片段;重组海参溶菌酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌与原始菌株WB600相比生长趋势基本一致,外源基因的插入对菌体的生理代谢未造成太大影响;在无选择压力的条件下,重组质粒的稳定性良好,连续传5次后的遗传稳定性为94%,并且提取质粒和双酶切验证后发现工程菌没有发现重排或丢失现象。表明重组海参溶菌酶基因工程菌pHT43-SjLys/WB600构建成功。
- 孙璐刘志文邹丹李丹潘博丛丽娜
- 关键词：基因重组枯草芽孢杆菌基因工程菌
- 日本对虾c型溶菌酶的高效重组表达及产物分析被引量：7
- 2012年
- 从日本对虾(Marsupenaeus japonicus)血液中提取总RNA,根据GenBank已登录的该cDNA序列(AB080238),通过RT-PCR技术扩增出日本对虾溶菌酶(MjLys)成熟肽基因。该基因完整的开放阅读框为477 bp,编码158个氨基酸(aa),前18 aa为信号肽,成熟肽由140 aa组成,分子量为16.4 kD,理论等电点(pI)为8.80。经分析表明,该基因含有一个完整的c型溶菌酶结构域(1-130 aa),包括c型溶菌酶特有的两个活性中心Glu33和Asp50,以及8个保守结构Cys残基。将MjLys成熟肽基因亚克隆至原核表达载体pET-32a(+),在大肠杆菌细胞BL21(DE3)pLysS中诱导发酵,实现了重组MjLys蛋白的高效表达,并测定了该重组蛋白对几种细菌的抑菌活性。结果表明,重组日本对虾溶菌酶对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和溶壁微球菌均有显著的溶菌活性。
- 杨杰丛丽娜夏涛常艺海栾桂花
- 关键词：甲壳纲动物日本对虾
- 重组海参溶菌酶的表达及其性质
- 2014年
- 研究了重组海参（Stichopusjaponicus）溶菌酶（SjLys）可溶性表达的发酵条件。采用多因素正交优选法，以摇瓶培养方式从培养基组分、发酵条件两个方面对重组海参溶菌酶进行研究，构建了高效分泌型表达重组海参溶菌酶工程菌。研究结果发现，30℃、140r／min、IPTG浓度0．3mmol／L、诱导后继续培养14h，目的蛋白分泌表达量可达到30-40mg／L，且产物以大量可溶性蛋白存在。
- 卢冬丛丽娜姜启晨谭广毅
- 关键词：可溶性
- 响应面法优化海洋枯草芽孢杆菌HS-A38增殖发酵培养基被引量：10
- 2012年
- 在摇瓶培养条件下,优化提高海洋枯草芽孢杆菌菌体浓度的发酵培养基组分。采用Plackett-Burman法确定了影响菌体浓度的显著性因子,即葡萄糖和ZnSO4;通过最陡爬坡实验逼近这两个重要因子的最大响应稳定区域,采用中心组合实验确定显著性因子的最佳水平,并用Design expert 7.13软件进行回归分析。优化后培养基的组成为:葡萄糖8.49g/L,豆粕粉12.0g/L,尿素0.625g/L,酵母膏4.0g/L,K2HPO44.0g/L,ZnSO40.053g/L。优化后的活菌浓度达到1.64×109 cfu/mL,与优化前菌体浓度(7.22×108 cfu/mL)相比,提高了1倍多。通过统计优化培养基组分可有效提高海洋枯草芽孢杆菌HS-A38的发酵液菌体浓度。
- 张欢丛丽娜侯英敏王丹谢三群
- 关键词：枯草芽孢杆菌响应面法活菌数
