国家自然科学基金(31360527)
- 作品数：14 被引量：38H指数：3
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- 荒漠昆虫小胸鳖甲抗冻蛋白MpAFP698对酿酒酵母的低温保护作用被引量：2
- 2017年
- 昆虫抗冻蛋白作为天然无毒副作用的低温和冷冻保护剂,在发酵菌种的保藏方面具有很好应用前景。为了验证荒漠昆虫小胸鳖甲(Microdera punctipennis)抗冻蛋白Mp AFP698对酵母菌的抗冻和抗低温保护效果,对Mp AFP698抗冻蛋白进行原核表达和纯化,获得了具有活性的融合抗冻蛋白MBP-Mp AFP698。将质量浓度为1、10、30μg/m L的MBP-Mp AFP698添加到酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中,在-7和-20℃冷冻处理酵母菌液不同时间;以10μg/m L的抗冻蛋白在4、0、-50℃处理酵母菌液,在-20℃反复冻融处理,观察菌落形态并统计菌种存活率。结果表明,添加抗冻蛋白组的酵母存活率显著优于未加抗冻蛋白的对照组,1μg/m L就有保护效果,10μg/m L保护效果最好,说明昆虫抗冻蛋白能以极低的浓度发挥低温保护作用。
- 张凤娟孙琳洁李素丽马纪
- 关键词：酿酒酵母细胞存活
- 荒漠昆虫小胸鳖甲Ras GTP酶激活蛋白基因MpRasGAP的克隆及低温表达分析被引量：3
- 2015年
- 【目的】丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)级联是细胞的重要信息传递系统之一,Ras GTP酶激活蛋白(Ras GTPase-activating protein,Ras GAP)基因Ras GAP和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun Nterminal kinase,JNK)基因JNK分别是MAPK信号转导途径的上、下游基因。本研究旨在确定荒漠昆虫小胸鳖甲Microdera punctipennis Ras GAP及JNK基因对低温的响应情况。【方法】从荒漠甲虫小胸鳖甲中克隆获得Ras GAP基因的c DNA序列,利用生物信息学分析软件分析其氨基酸序列并构建进化树,利用实时荧光定量PCR检测低温胁迫条件下Ras GAP和JNK基因的表达情况。【结果】小胸鳖甲Ras GAP c DNA的开放阅读框2 523 bp,命名为MpRas GAP(Gen Bank登录号:KM677930),编码840个氨基酸,分子量96.594 k Da,编码蛋白MpRas GAP属于Ras GAP超家族。MpRas GAP与赤拟谷盗Tribolium castaneum Ras GAP的氨基酸序列一致性达89%。小胸鳖甲在4℃和-4℃低温胁迫1 h后,MpRas GAP的mRNA水平都显著高于室温对照(25℃)。小胸鳖甲在4℃处理3 h或-4℃处理1 h后,Mp JNK的mRNA水平也显著升高。【结论】本研究结果表明小胸鳖甲MpRas GAP和Mp JNK的mRNA水平受低温诱导。研究结果有助于深入研究荒漠昆虫在低温下MAPK信号转导途径的作用机制。
- 阮梦鸽李洁琼孟闪闪马纪
- 关键词：低温胁迫RASMRNA水平实时定量PCR
- 荒漠昆虫小胸鳖甲抗菌肽Attacin基因的克隆及低温表达模式分析被引量：3
- 2013年
- 昆虫在低温冷驯化过程中会发生很多基因表达的改变， 从转录组层面上开展广泛的研究有助于全面认识昆虫对冷响应的分子机制。为了对荒漠昆虫小胸鳖甲Microdera punctipennis的 4℃低温转录组数据中一个上调表达的Attacin基因（MpAttacin1）进行深入了解并分析其对低温诱导的响应情况， 本研究通过生物信息学分析对该基因进行了鉴定， 并利用实时荧光定量PCR对其在低温下的mRNA水平进行了检测。结果表明： 获得的MpAttacin1 cDNA长度为523 bp， 包含一个456 bp的开放阅读框和67 bp的5′端非翻译区。MpAttacin1编码含有151个氨基酸残基的多肽， N端含有17个氨基酸的信号肽序列。同源性分析表明， 其氨基酸序列与其他鳞翅目、 双翅目和鞘翅目昆虫的抗菌肽Attacin具有30%~40%的一致性。以邻接法（neighbor-joining， NJ）构建的系统进化树表明， 小胸鳖甲Attacin1与其他鞘翅目昆虫的Attacin起源于共同的祖先， 属于Attacin_C超家族。实时荧光定量PCR分析结果显示， 在4℃与-4℃低温胁迫时， MpAttacin1基因的转录都呈现先升高后降低的应激反应趋势， 但在对低温的响应时间和强度上有所不同。在4℃处理5 h和9 h后， MpAttacin1的表达量分别为对照组的2.3和3.8倍， 而在-4℃处理7 h和9 h后， 分别为对照组的2.4和1.5倍。这些研究表明， 除已知的抗菌功能外， Attacin在昆虫的低温适应过程中可能也发挥着重要的作用。
- 李洁琼陆雪莹刘小宁马纪
- 关键词：荒漠昆虫抗菌肽表达谱
- 荒漠甲虫小胸鳖甲胞外信号调节激酶ERK基因的克隆与低温表达谱分析被引量：2
- 2015年
- 昆虫属变温生物,冷胁迫是其最常见的环境刺激。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路与细胞应对外界刺激密切相关,为了解MAPK信号通路在荒漠甲虫小胸鳖甲耐寒机制中的作用,从小胸鳖甲4℃转录组数据中筛选出胞外信号调节激酶(ERK)基因的全长c DNA,命名为Mp ERK。生物信息学分析表明,Mp ERK全长1125 bp,编码374个氨基酸。Mp ERK的理论分子量是43 k Da,含有ERK激酶所共有的磷酸化位点,属于MAPK超家族,与其它物种ERK的一致性达80%以上。实时定量PCR检测Mp ERK基因在低温下的表达谱发现,4℃处理1 h后,Mp ERK基因的表达上调为对照的7.5倍,5 h时达到高峰,为对照的15倍。-4℃处理1 h后,Mp ERK基因的表达上调为对照的8.4倍,5 h时达到高峰,为对照的13.75倍。研究结果表明Mp ERK基因是冷响应的,可能在小胸鳖甲应对低温时发挥信号转导作用。
- 孟闪闪李洁琼阮梦鸽陆雪莹马纪
- 关键词：MAPK通路胞外信号调节激酶ERK信号通路
- 中华齿刺甲和黄粉虫抗冻蛋白基因3'-UTR序列的克隆及其差异性比较被引量：3
- 2015年
- 真核基因的3’-非翻译区(untranslated region,UTR)对转录后调控具有重要作用。抗冻蛋白(antifreeze protein,AFP)是变温生物抵御环境低温胁迫的重要物质。昆虫抗冻蛋白基因3’-UTR的序列变异性可能与昆虫的环境适应性相关,为验证这一假设,通过3’-末端快速扩增法(3’-RACE)克隆了生境条件极端差异的拟步甲科昆虫中华齿刺甲(Oodescelis chinensis)和黄粉虫(Tenebrio molitor)成虫及幼虫的抗冻蛋白基因(afp)的3’-UTR,并进行序列比较。结果表明,通过克隆获得两种昆虫的众多afp 3’-UTR c DNA序列。生境条件单一的黄粉虫afp 3’-UTR的长度几乎没有变异,变异系数为零,序列一致性达90%以上,而野生昆虫中华齿刺甲的afp 3’-UTR序列在长度和组成上变异巨大,长度变异系数为0.26~0.32,序列一致性只有29%。黄粉虫afp3’-UTR序列含有两个AAUAAA多聚腺苷酸化信号和两个富U/GU元件;中华齿刺甲afp 3’-UTR一般仅含一个AAUAAA信号和一个富U/GU元件,有些序列没有可识...
- 汪露张凤娟李肇阳陶波林马纪
- 关键词：黄粉虫抗冻蛋白
- 荒漠甲虫小胸鳖甲抗冻蛋白的酵母表达及应用被引量：2
- 2015年
- 昆虫抗冻蛋白(Antifreeze protein,AFP)的抗冻活性很高,可应用于生物组织和细胞的低温保存。为了在酵母中表达荒漠甲虫小胸鳖甲Microdera punctipennis抗冻蛋白Mp AFP698,并确定其在低温下的保护作用,本文通过构建真核表达载体p PIC9K-Mpafp698,转化巴斯德毕赤酵母GS115,诱导表达小胸鳖甲抗冻蛋白Mp AFP698。利用免疫印迹(Western blotting)分析Mp AFP698蛋白的特异性表达,结果显示Mpafp698基因可整合到酵母基因组中并分泌表达,且酵母自身蛋白很少分泌表达。检测抗冻蛋白的低温保护作用,结果发现,小胸鳖甲抗冻蛋白可显著改善冷冻小鼠肝脏等器官的细胞形态,降低血细胞在4℃的溶血率,提高SF9细胞冻融后的存活率。本研究表明,小胸鳖甲AFP可以在毕赤酵母中分泌表达,便于纯化,有良好的低温保护效果。
- 孟闪闪蔡文萍马纪
- 关键词：抗冻蛋白巴斯德毕赤酵母血细胞
- 荒漠昆虫小胸鳖甲几丁质酶抗血清的制备及抗体效价检测被引量：1
- 2014年
- 目的几丁质酶是昆虫重要的防御物质,本研究采用DNA-蛋白质联合免疫策略制备荒漠昆虫小胸鳖甲几丁质酶(MpCHI786)的抗血清,用于检测小胸鳖甲在外界不良条件下几丁质酶的变化。方法从小胸鳖甲成虫中提取总RNA,反转录后RT-PCR扩增Mpchi786 cDNA,构建原核表达载体pET30a-Mpchi786,在大肠杆菌BL21中用IPTG诱导表达获得融合蛋白His-MpCHI786。对融合蛋白切胶纯化后与弗氏佐剂混合作为抗原。另外,构建真核表达质粒pcDNA3.0-Mpchi786,对小鼠尾静脉高压注射,8 h后RT-PCR检测其在肝脏的瞬时表达。以pcDNA3.0-Mpchi786肌肉注射免疫小鼠3次后,再用His-MpCHI786融合蛋白加强免疫2次,DNA免疫和免疫结束后收集免疫小鼠的血清,ELISA和Western blot法检测抗血清效价和特异性。结果 RT-PCR结果显示尾静脉高压注射8 h后,pcDNA3.0-Mpchi786质粒在小鼠肝脏有特异性表达。Western blot检测表明,用His-MpCHI786融合蛋白作为抗原,pcDNA3.0-Mpchi786DNA质粒免疫3次的抗血清和His-MpCHI786融合蛋白加强免疫2次后的抗血清都显示了特异性反应条带。ELISA检测结果显示抗血清效价高达1∶204 800以上。结论利用DNA-蛋白质联合免疫法能够获得效价高、特异性的小胸鳖甲几丁质酶MpCHI786的抗血清。
- 陆雪莹李洁琼庄淑珍刘小宁马纪
- 关键词：几丁质酶抗血清抗体效价
- 荒漠甲虫小胸鳖甲低温响应几丁质酶基因Mpcht19的克隆及表达模式分析被引量：3
- 2017年
- 【目的】探索荒漠昆虫小胸鳖甲Microdera punctipennis低温响应的分子机理并挖掘其耐寒基因。【方法】根据低温转录组数据筛选并克隆小胸鳖甲几丁质酶基因,并进行生物信息学分析;通过实时荧光定量PCR和免疫组织化学法分析该基因在成虫不同组织中和4℃低温胁迫下的表达模式分析。【结果】从小胸鳖甲成虫克隆获得一个几丁质酶基因Mpcht19(Gen Bank登录号:KY126382)。生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白Mp CHT19属于Ⅳ型昆虫几丁质酶,理论分子量约为27.18 k D,无信号肽,具亲水性。系统进化分析表明,Mp CHT19与赤拟谷盗Tribolium castaneumⅣ型几丁质酶Tc CHT19同源性最高,氨基酸序列一致性为34.05%。实时荧光定量PCR结果显示,Mpcht19在成虫脂肪体和后肠中高表达,具有组织特异性;该基因的表达还受4℃低温诱导。免疫组织化学分析结果显示,在4℃低温下Mp CHT19蛋白在脂肪体和后肠中表达。【结论】Mpcht19基因的表达具有组织特异性,并受低温诱导。研究结果有助于深入研究几丁质酶与小胸鳖甲耐寒性的关系。
- 蔡卿龄陆雪莹马纪
- 关键词：几丁质酶低温胁迫免疫组织化学
- 荒漠昆虫小胸鳖甲转录组微卫星的生物信息学分析被引量：5
- 2017年
- 位于蛋白质编码区及非编码区(可转录区)的微卫星是常用的一种功能分子标记。本研究以荒漠拟步甲科昆虫小胸鳖甲(Microdera punctipennis)为材料,从其转录组数据库中筛选出由1~6个碱基单元组成的简单序列重复进行分析,并对其微卫星的丰度和特征进行描述。研究显示,小胸鳖甲转录组中微卫星的分布频率为7.94%。其中,单碱基重复序列占微卫星的47.17%,是最丰富的重复序列;其次为3碱基重复序列,占39.81%,而2、4、5、6碱基重复序列分别占10.94%、0.90%、0.88%和0.29%。将小胸鳖甲转录本与同为拟步甲科的赤拟谷盗(Tribolium castaneum)编码序列进行比对,分析同源序列微卫星基元(motif)发现,二者蛋白质编码区微卫星具有高度物种特异性。对小胸鳖甲低温响应转录本和总转录本进行微卫星基元和不同长度微卫星重复次数的比较发现,它们之间没有显著性差异。对含有微卫星的冷响应基因进行基因本体论(gene ontology,GO)分析,发现主要富集到生物学过程、分子功能和细胞组分3个类群。
- 库尔班·吐松陈真刘小宁马纪
- 关键词：转录组微卫星特异性
- 荒漠昆虫小胸鳖甲水通道蛋白基因MpAQP1克隆及低温对其表达的影响被引量：2
- 2017年
- 水通道蛋白(aquaporin,AQP)参与细胞的水分平衡与运输,与生物的抗逆性相关,但AQP在昆虫耐寒性中的作用仅有少量报道。为了检测昆虫AQP基因的序列特征及其表达是否与低温相关,本研究从荒漠甲虫小胸鳖甲Microdera punctipennis中克隆获得AQP的开放阅读框(ORF)序列,命名为MpAQP1(Gen Bank登录号:KX129951)。生物信息学分析表明,MpAQP1的ORF长度为813 bp,编码270个氨基酸,分子量为28.59 kDa,理论等电点为7.73。MpAQP1属于萤火虫内嵌蛋白(PRIP)家族,具有6个跨膜结构域和5个螺旋环,含有高度保守的天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸基序(NPA基序)。实时荧光定量PCR检测MpAQP1在低温下的表达谱发现,4℃低温处理1 h,MpAQP1开始上调表达,5 h达到最高峰,为对照组的34.39倍。研究表明MpAQP1为冷响应基因,水通道蛋白可能参与小胸鳖甲低温下的渗透调节而发挥耐寒性功能。
- 李耀华刘小宁马纪
- 关键词：水通道蛋白耐寒性
