国家自然科学基金(31171643)
- 作品数：3 被引量：5H指数：2
- 相关作者：钞亚鹏钱世钧宋炳红钟健岳洋更多>>
- 相关机构：中国科学院北京航空航天大学中国科学院大学更多>>
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- 相关领域：生物学轻工技术与工程化学工程更多>>
- 基于分子动力学模拟的高γ-环糊精专一性环糊精糖基转移酶理性改造被引量：1
- 2020年
- 【背景】环糊精糖基转移酶的分子动力学模拟较传统基因改造而言能有效提高改造效率,减少盲目性。【目的】探究环糊精糖基转移酶的催化专一性机理,为获得产γ-环糊精专一性更高的环糊精糖基转移酶提供高效突变菌株方法。【方法】通过分子对接和分子动力学模拟,获得3种产物类型CGTase与底物的对接模拟结构,并通过定点突变实验进行验证。【结果】分子动力学模拟结果显示α-和β-CGTase与十糖链在酶蛋白S1区域呈现闭合的形态,而γ-CGTase和十糖链在S1区域呈现更易于生成γ-环糊精的张开形态;3种CGTase与十糖链在相同位置存在氢键的氨基酸共有17个相对应位点,其中14个位点的氨基酸种类一致,不一致的3个氨基酸对应α-CGTase位点分别为Y89、D234和Y262。本研究对Y262位点进行定点突变和产物专一性实验,结果显示经过分子动力学预测的Y262L有助于提高产γ-CD专一性,从野生酶的13.7%提高到39.9%,γ-环糊精产物比例提高了3倍。【结论】分子动力学模拟结果对于指导环糊精糖基转移酶的专一性内在机理具有一定的正向指导意义。
- 范婷文范耿文侯艾琦陈倩媚钞亚鹏孙艳
- 关键词：环糊精分子动力学模拟
- 重组α-环糊精葡萄糖基转移酶表达条件的优化及其产物专一性的分析被引量：2
- 2012年
- 将来源于Bacillus sp 602-1的α-环糊精葡萄糖基转移酶(α-CGT)基因(cgt)插入到表达载体PQE30中,构建重组质粒PQE30/cgt,成功转化宿主菌E.coli M15后,得到重组菌株E.coli M15(PQE30/cgt)。在IPTG的诱导下得到酶表达的最适条件:TB培养基,0.01 mmol/L IPTG,诱导温度16℃,胞内酶比活力最高可达5 209 U/mL;加入IPTG 24 h后,添加甘氨酸和甘露醇会促使酶向胞外分泌。酶蛋白自诱导表达的适宜条件为在TB培养基中添加乳糖3.0 g/L,葡萄糖1.2 g/L,16℃培养96 h,酶比活力达到8 635 U/mL,明显高于IPTG诱导的效果。通过SDS-PAGE验证了上述结论。酶催化转化实验表明:重组酶转化质量分数为1%可溶淀粉24 h后,α-环糊精(α-CD)转化率可达38.2%,α和β的峰面积比约为3.4∶1,α-CD具有较高的专一性,因此该重组α-CGT酶具有较好的工业化应用前景。
- 宋炳红薛智权钟健朱启忠钞亚鹏钱世钧
- 关键词：Α-环糊精葡萄糖基转移酶
- α-环糊精糖基转移酶活性区域突变提高选择形成γ-环糊精能力被引量：2
- 2013年
- 探讨α-环糊精糖基转移酶（CGT酶）活性区域-3亚位点（47位赖氨酸残基），-7亚位点（146～152位氨基酸残基）以及环化中心位点（195位酪氨酸残基）对其催化底物形成Y一环糊精（CD）能力的影响。将α-CGT酶相应位点分别进行如下突变：K47T，Y195I，以及146～152位氨基酸残基替换为异亮氨酸（命名为△6），并在大肠杆菌BL21中实现异源活性表达。以可溶性淀粉作为底物进行转化，利用HPLC分析各种突变酶的催化产物中3种环糊精产量和比例。结果表明，和野生酶相比，所有突变酶的淀粉水解活性和环糊精总生成量都有不同程度的下降。在产物的组成方面，突变酶Y1951的催化产物中，α-CD的含量由68％降为30％，β—CD由22．2％提高为33．3％；而γ-CD由8．9％提高为36．7％，含量提高了4倍，取代α-CD成为产物中的主要成分；γ-CD的实际产量为1．1g／L，是野生酶（0．4g／L）的3倍。突变酶K47T和△6的转化产物中α-CD比例有不同程度下降，但仍然是产物中的主要组分，β-和γ-CD的比例都有所增加。由此可见，活性区域中195位氨基酸对于α-CGT酶的活力和催化选择性具有重要的影响，Y195I突变体酶最有利于选择性形成γ—CD。纯化后突变酶Y1951的酶学性质试验表明，其最适反应温度和野生酶相同，但最适反应pH有所提高，且比野生酶具有更好的pH稳定性。因此，突变酶Y195I具有生产制备γ-CD的潜力。
- 谢婷岳洋宋炳红钞亚鹏钱世钧
- 关键词：Β-CD突变
