北京市自然科学基金(7042055)
- 作品数：6 被引量：6H指数：2
- 相关作者：赵声明常乃柏顾惜春彭明婷许晓东更多>>
- 相关机构：北京医院卫生部临床检验中心中国协和医科大学更多>>
- 发文基金：北京市自然科学基金首都医学发展科研基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 转JAK2基因脐血CD34^+细胞体外扩增与生物学特性研究被引量：1
- 2007年
- 目的:探讨转基因JAK2介导的脐血干祖细胞长期扩增调控的可行性和转基因细胞的生物学特征。方法:构建逆转录病毒载体MGI-F2JAK2,内含有JAK2基因的功能催化区和2个与小分子靶向基因合成药物(AP20187)结合的位点蛋白(F36v,F2)。应用MiniMACS磁珠分选系统纯化分离脐血CD34+细胞,用含JAK2的逆转录病毒上清转染脐血CD34+细胞。转染后的CD34+细胞在IMDM培养体系中,将细胞分为AP20187组;FL组;TPO组;AP20187+FL+TPO(AFT)组。对扩增后的细胞定期检测基因转移后GFP动态变化、细胞免疫标记、造血祖细胞集落培养、染色体核型分析和裸鼠致瘤实验。结果:分选的CD34+细胞纯度>91%,基因转移率为49.32%±6.21%;只有AP20187+FL+TPO组可以使转基因的脐血CD34+细胞大量增殖,扩增至第8周时细胞数达109,CD34+细胞GFP的阳性率由基线水平逐渐上升并于第8周时达到90%以上;细胞表型为CD33+、CD61+、Gly-A+部分阳性;CD38+、HLA-DR+强阳性;CD2、CD7、CD19接近阴性。扩增的CD34+细胞可分别形成BFU-E、CFU-GM、CFU-Mix并以CFU-GM集落为主。扩增后CD34+细胞检测染色体核型正常,裸鼠实验无致瘤特性。结论:转染JAK2基因的人脐血CD34+细胞协同FL和TPO细胞因子可以体外长期扩增脐血干祖细胞,对今后研究细胞信号转导、造血调控以及开展干细胞和基因治疗都有潜在的应用价值。
- 赵声明顾惜春常乃柏许晓东裴蕾
- 关键词：基因疗法CD34^+细胞
- 血液恶性肿瘤细胞系体外培养模型的建立(英文)被引量：3
- 2013年
- 本研究旨在建立一套血液恶性肿瘤的体外细胞培养模型。构建几种带有GFP(绿色荧光蛋白)表达并能够编码不同白血病/淋巴瘤相关融合蛋白的逆转录病毒载体(如:TEL-PDGFR,Rabaptin5-PDGFR,p210BCR-ABL,AML1-ETO,NPM-ALK);将病毒载体导入小鼠的原始骨髓细胞,转导的骨髓细胞随后培养在含有10%FCS的IMDM中。将细胞分为:无生长因子组和含有不同生长因子的各种组合组:①c-kit联合flt3(KL+FL)组,②IL-3+TPO+G-CSF+Hyper-IL-6(3/T/G/H6)组,③KL+FL+3/T/G/H6组。用流式细胞术检测肿瘤融合蛋白联合各种生长因子支持骨髓转导细胞的自我更新、扩增生长的能力。结果表明,转导的细胞能够持续对数级的生长扩增。KL联合FL能够支持转导编码TEL-PDGFR、Rabaptin5-PDGFR、AML1-ETO、NPM-ALK病毒载体的骨髓细胞自我更新、生长扩增;而转导p210 BCR-ABL病毒载体的骨髓细胞除需要KL和FL外,还需要IL-3的参与。扩增培养的细胞形态与所对应的肿瘤基因相关的血液肿瘤细胞相一致。结论:本研究建立了一套体外模型培养体系,提供了一种研究血液恶性肿瘤的方法,可用于筛选血液肿瘤的治疗性药物。
- 赵声明王建祥刘辉彭明婷
- 关键词：血液恶性肿瘤细胞培养体外
- 靶基因调控的脐血干/祖细胞体外长期扩增与调控(英文)
- 2008年
- 背景:脐血干细胞是基因治疗最理想的靶细胞之一,但基因转移率低下是目前面临的主要障碍。酪氨酸激酶 JAK2 在造血干/祖细胞自我更新中扮演着重要的作用,为了克服脐血基因转移率低下的障碍,根据基因调控表达技术原理,是否可开发一个可以靶向扩增 JAK2基因修饰的脐血 CD34+细胞体系。目的:探讨转基因 JAK2 介导的脐血干祖细胞长期扩增调控的可行性和安全性。单位:卫生部北京医院血液科。材料:实验于 2003-06/2006-04 在卫生部北京医院血液科实验室完成。脐血取自健康、足月、自然分娩后立即断脐的脐血。脐血由北京医院妇产科提供,产妇及家属均知情同意,实验经医学伦理委员会批准。MiniMACS 磁性分离仪、免疫磁珠吸附 CD34 单抗购自德国 Miltenyi Biotec 公司, 流式细胞仪购自美国 FACScalibur,人重组干细胞因子、Flt3 配体、人白介素-6、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子、血小板生成素为 PeproTec 产品,SPF级裸鼠购自北京医科大学动物中心。方法:构建逆转录病毒载体 MGI-F2JAK2,内含有 JAK2 基因的功能催化区和两个与小分子靶向基因合成药物(AP20187)结合的位点蛋白(2xF36v,F2)组成。AP20187 可与 F36v 特异结合引起 JAK2 二聚化而激活细胞内信号传导。该载体同时含有绿色荧光蛋白报告基因,用作检测细胞增殖的标记。应用 MiniMACS 免疫磁珠分选系统纯化分离脐血 CD34+ 细胞,用含 JAK2 的逆转录病毒上清转染脐血CD34+细胞。转导后的 CD34+ 细胞在集落刺激因子、Flt3 配体、血小板生成素、白介素-6 细胞因子的联合培养条件下,以不加或加入AP20187 分别作为对照组和实验组。主要观察指标:①应用流式细胞仪测定两组 CD34+细胞中所含绿色荧光蛋白细胞的百分率,确定基因转移率。②扩增后的脐血祖细胞集落培养结果。③取培养 10 周的脐血 CD34+细胞于裸
- 赵声明彭明婷顾惜春常乃柏
- 关键词：基因治疗脐血CD34+细胞扩增
- 转导JAK2基因可促进原始多能造血细胞在体外的长期扩增被引量：2
- 2004年
- 目的 探讨激活JAK2信号通路是否能够长期扩增调控造血干祖细胞并评价扩增细胞的定向分化潜能。方法 构建克隆 1个含有JAK2基因和二聚化化学诱导物 (AP2 0 187)结合位点所组成的逆转录病毒载体。AP2 0 187可以使JAK2二聚化激活细胞内信号传导。将该载体转入小鼠原始骨髓造血细胞 ,在无血清培养基中 ,将JAK2转基因的细胞分为 :①空白对照组 ,②AP2 0 187组 ,③细胞因子联合组 [干细胞因子 (SCF) +Flt3 配体 (Flt3 L) ],④AP2 0 187+SCF +Flt3 L组。对扩增的细胞进行免疫表型、定向分化、造血祖细胞集落分析及脾集落形成单位的研究。结果 只有AP2 0 187+SCF+Flt3 L组能够使JAK2转基因的骨髓细胞持续大量对数级增殖。约 8d时 ,细胞数量可以达到扩增前的 10 19倍。扩增的细胞经流式细胞仪检测为 :Sca1阳性细胞为 5 2 %～ 98% ,C kit阳性率为 5 6 %～6 9 % ,CD34阳性率 4 0 %～ 85 % ;而其他表型TER119阳性 0～ 2 0 % ,CD4 1阳性 5 %～ 36 % ,B2 2 0阳性12 %～ 4 6 % ,Gr1阳性 6 %～ 17% ,CD11b阳性 35 %～ 4 6 % ,CD3为阴性。扩增细胞在SCF/粒细胞 巨噬细胞集落刺激因子 (GM CSF) /白介素 (IL) 3条件下 ,可分化形成明显的粒细胞和巨噬细胞 ;在SCF/红细胞生成素 (EPO)条件下 ,可分化为红细胞 ;
- 赵声明常乃柏顾惜春
- 关键词：体外扩增造血干细胞基因扩增定向分化
- 靶基因调控的脐血干/祖细胞体外长期扩增与调控的实验研究
- 2006年
- 目的探讨转基因JAK2介导的脐血干祖细胞长期扩增调控的可行性和安全性。方法构建逆转录病毒载体MGI-F2JAK2,内含有JAK2基因的功能催化区和两个与小分子靶向基因合成药物(AP20187)结合的位点蛋白(2xF36v,F2)组成。AP20187可与F36v特异结合引起JAK2二聚化而激活细胞内信号传导。该载体同时含有绿色荧光蛋白(GFP)报告基因,用作检测细胞增殖的标记。应用MiniMACS免疫磁珠分选系统纯化分离脐血CD34+细胞,用含JAK2的逆转录病毒上清转染脐血CD34+细胞。转导后的CD34+细胞在SCF、FL、TPO、IL-6细胞因子的联合培养条件下,以不加或加入AP20187分别作为对照组和实验组。定期检测CD34+细胞基因转移后GFP动态变化、细胞免疫标记、造血祖细胞集落培养和裸鼠致瘤试验。结果分选的CD34+细胞纯度为91%以上,基因转移率为49．3%±6．2%；实验组AP20187+SCF+FL+TPO+IL-6(ASFTI)与对照组SCF+FL+TPO+IL-6(SFTI)组均可获得CD34+细胞大量扩增。随着培养时间的延长,实验组扩增的CD34+细胞GFP阳性率由基线水平逐渐上升于第11周时达到95%以上,而对照组GFP阳性率逐渐下降到基线水平以下并逐渐消失。在培养6周左右,实验组CD34+CD38-、CD34+CD38+细胞亚群扩增倍数分别为(228．26±32．31)、(321．48±40．52),分别与对照组相比,差异有显著性。ASFTI组转基因CD34+细胞于12周后仍可产生造血祖细胞集落(BFU-E、CFU-GM、CFU-Mix)。扩增后CD34+细胞检测染色体核型正常,裸鼠实验无致瘤特性。结论转染JAK2基因的人脐血CD34+细胞协同其他细胞因子可以体外长期扩增脐血干祖细胞,对今后开展干细胞治疗某些遗传性血液病有潜在的应用价值。
- 赵声明彭明婷顾惜春常乃柏
- 关键词：基因治疗脐血CD34+细胞扩增
- 转基因JAK3体外长期扩增T淋巴祖细胞的实验研究
- 2006年
- 目的探讨激活JAK3信号传导通路是否能够体外长期扩增调控T淋巴祖细胞并评价其定向分化潜能的可行性。方法构建含有JAK3基因的逆转录病毒载体MG I-F2JAK3,内含有绿色荧光蛋白(GFP)和两个可以结合小分子二聚化合物AP20187的结合位点F36v。将该载体转入小鼠的骨髓造血干细胞中,在无血清培养基X-V ivo15培养体系中扩增,分为4组:空白对照组;AP20187组;干细胞因子(SCF)组;AP20187+SCF组。对扩增的细胞进行流式细胞仪检测免疫分型,定向分化、胸腺内注射等研究。结果AP20187+SCF组可以使转导的造血细胞获得长期大量对数级的扩增,扩增50 d后细胞可以达到1.2×1012倍±0.2×1012倍,所扩增的细胞为最早期的T淋巴祖细胞,表型为C-k ith iCD44+CD25-TN。该祖细胞群在SCF+IL-7+IL-3培养条件下,可定向分化为Thy1.2阳性的T淋巴细胞,并在小鼠的胸腺内可定向分化为GFP+CD3+和GFP+CD4+双阳性的成熟T淋巴细胞。结论AP20187联合SCF激活JAK3信号,可以大量扩增最早期的T淋巴祖细胞。该祖细胞具有定向分化为成熟T淋巴细胞的功能。该系统有助于研究T淋巴细胞的发生发育。
- 赵声明顾惜春常乃柏许晓东彭明婷
- 关键词：转基因扩增
