国家自然科学基金(31100138)
- 作品数：8 被引量：26H指数：4
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- 衣原体噬菌体phiCPGl衣壳蛋白Vpl对沙眼衣原体的作用研究被引量：13
- 2012年
- 目的将原核表达纯化的衣原体噬菌体phiCPGl衣壳蛋白Vpl作用于沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis，Ct），以期发现该Vpl蛋白对Ct生长的影响。方法原核表达并纯化噬菌体phiCPGl的衣壳蛋白Vpl，将纯化后的蛋白复性后与ct的标准株或临床野生株（终浓度为53μg／m1）室温孵育3h后接种至单层致密McCoy细胞中，培养过程中均加入了Vpl蛋白，48h后碘染色包涵体计数和透射电镜观察Vpl蛋白对Ct生长的影响；MTT法检测Vpl蛋白对McCoy细胞系的细胞毒性作用；液体培养基稀释法检测Vpl蛋白对大肠杆菌BL21和DH5ct的抗菌作用。结果衣壳蛋白Vpl对Ct标准株E和D型的抑制率分别为78％和72％，对Ct临床野生株的抑制率为40％-70％，透射电镜结果显示Vpl蛋白能够抑制Ct的正常发育，使包涵体内出现异常增大的网状体。而该Vpl蛋白对非衣原体的其他生物体如大肠杆菌BL21、DH5α和真核细胞McCoy的生长没有影响。结论噬菌体衣壳蛋白Vpl对Ct的生长具有明显的抑制作用，为临床上Ct感染的治疗提供了新的思路。
- 刘原君侯淑萍卫酒荣李燕齐蔓莉王惠平刘全忠
- 关键词：沙眼衣原体VP1蛋白
- 衣原体噬菌体phiCPG1衣壳蛋白Vp1在D型沙眼衣原体外膜中结合位点的检测被引量：5
- 2012年
- 目的发现噬菌体phiCPGl衣壳蛋白Vpl在沙眼衣原体中的结合位点，为理解噬菌体与衣原体的相互作用提供线索。方法诱导表达噬菌体phiCPGl的衣壳蛋白Vpl，通过胶回收进行目的蛋白的纯化，复性后以Far-Western印迹技术检测Vpl是否能与衣原体外膜中重组多形外膜蛋白（rPmp）家族及主要外膜蛋白（MOMP）结合。结果在大肠埃希菌中成功表达蛋白Vpl；抗Vpl的单克隆抗体作为一抗进行Western印迹，结果无特异性条带出现，可见针对Vpl的单克隆抗体不与任何一种rPmp结合。Far-Western印迹结果显示，在rPmpI的位置出现明显的条带，在相对于其他rPmp和MOMP的位置无特异性条带的出现，证实Vpl能特异结合D型沙眼衣原体标准株的外膜蛋白rPmpI。结论沙眼衣原体外膜中有Vpl的结合位点，可能通过和rPmpI的结合从而特异性地与沙眼衣原体结合。
- 刘原君孙毅娜姚卫锋李燕李卓然卫酒荣刘全忠
- 关键词：细菌噬菌体细菌外膜蛋白质类
- D型沙眼衣原体质粒蛋白pgp3的克隆、表达、鉴定及其免疫原性初探被引量：5
- 2014年
- 目的获得D型沙眼衣原体质粒蛋白pgp3基因及其蛋白，并鉴定其免疫原性。方法PCR扩增目的基因，将其定向插入原核表达载体pGEX-6P-1中，连接产物转化入大肠埃希菌DH5c~，提取质粒进行酶切、测序、PCR鉴定。再将重组质粒转化人大肠埃希菌BL21并诱导表达，Western印迹鉴定目的蛋白，谷胱甘肽巯基转移酶（GST）磁珠纯化pgp3-GST融合蛋白。用纯化后的蛋白免疫新西兰家兔，Western印迹检测抗体与pgp3蛋白的结合，酶联免疫吸附试验（ELISA）测定抗体效价。结果克隆目的基因序列长度为795bp，与基因库中一致，Western印迹显示目的蛋白相对分子质量为54000，并得到纯化蛋白。所得兔血清可识别pgp3蛋白，ELISA检测多克隆抗体效价达1：25600。结论成功表达具有强免疫原性的pgp3-GST融合蛋白，为进一步研究奠定基础。
- 孔杰孙毅娜赵乐然肖萌王敬李卓然刘原君刘全忠
- 关键词：衣原体沙眼重组融合蛋白质类免疫法
- 运用穿梭质粒在小鼠沙眼衣原体中表达外源性基因
- 2015年
- 目的在能够转化小鼠沙眼衣原体的穿梭质粒pGFP：：CM中加入新的开放读码框，为研究衣原体单个蛋白功能奠定基础。方法用聚合酶链反应（PCR）扩增质粒pGFP：：CM和新的开放读码框（包括质粒蛋白pgp4的启动子、红色荧光蛋白mCherry基因和沙眼衣原体CT579的转录终止序列），将连接产物转化至大肠埃希菌感受态Stellar中，提取质粒进行PCR、酶切和测序鉴定。将重组质粒利用氯化钙法转化至无质粒的CMUT3中，荧光显微镜下观察并挑选带有荧光的转化衣原体包涵体，经过氨苄西林筛选和噬菌斑纯化后，采用间接免疫荧光染色法检测转化株CMUT3-pGFP·mCherry-CM中pgp3和glgA蛋白的表达。结果经PCR、酶切和测序鉴定后得到正确序列的重组质粒，转化CMUT3后可见含有绿色和红色荧光的衣原体包涵体。氨苄西林筛选和噬菌斑实验纯化后得到新的转化株CMUT3-pGFP-mCherry-CM。免疫荧光证实pgp3和glgA蛋白在衣原体CMUT3-pGFP-mCherry-CM和CMUT3-pGFP：：CM中表达相似。结论在质粒pGFP：：CM中成功加入开放读码框，转化衣原体后能够表达外源性基因，使衣原体转化技术能够用于衣原体蛋白质功能研究，为临床沙眼衣原体感染的防治提供新的线索。
- 刘原君孙毅娜马璟玥孔杰韩珑刘全忠
- 关键词：衣原体开放读码框基因表达
- 沙眼衣原体质粒蛋白pgp3多克隆抗体的制备及鉴定被引量：4
- 2014年
- 目的表达并纯化D型沙眼衣原体质粒蛋白pgp3，制备鼠源性多克隆抗体。方法诱导表达pgp3蛋白，经谷胱甘肽-S-转移酶（GST）磁珠纯化后免疫BALB／c小鼠，制备多克隆抗体，Western印迹、细胞免疫荧光鉴定抗体的特异性，间接ELISA法测定抗体效价。结果得到纯化的pgp3蛋白，获得鼠源性多克隆抗体，经Western印迹和细胞免疫荧光鉴定抗体可特异性结合pgp3蛋白，ELISA测定所得抗体效价为1：819200。结论成功制备具有高效价、高特异性的抗pgp3多克隆抗体。
- 孔杰孙毅娜赵乐然肖萌王敬马璟玥刘原君刘全忠
- 关键词：质粒
- D型沙眼衣原体多形外膜蛋白I的分段克隆表达及其免疫原性分析被引量：3
- 2016年
- 目的获得D型沙眼衣原体多形外膜蛋白（Pmp）I的全长（PmpI—FL）和羧基端蛋白（PmpI—C），并鉴定蛋白免疫原性。方法用PCR扩增目的基因PmpI—FL和PmpI—C，分别将其定向插入原核表达载体pGEX-6P-1中，连接产物转化人大肠埃希菌DH5a，提取质粒进行酶切、PCR、测序鉴定。再将重组质粒分别转化人大肠埃希菌BL21并诱导表达，考马斯亮蓝染色和免疫印迹鉴定目的蛋白，谷胱甘肽巯基转移酶（GST）磁珠分别纯化PmpI—FL—GST融合蛋白和PmpI-C-GST融合蛋白。用纯化后的蛋白分别免疫BALB／c小鼠，ELISA测定抗体效价。结果克隆目的基因PmpI—FL和PmpI—C的长度分别为2659和1195bp，序列均与基因库中一致，考马斯亮蓝染色和免疫印迹显示目的蛋白相对分子质量分别约为122000和69000；并得到纯化的蛋白。免疫小鼠所得血清经ELISA检测多克隆抗体效价达1：12800（抗PmpI-FL）和1：6400（抗PmpI-C）。结论成功表达具有强免疫原性的PmpI-FL-GST和PmpI-C—GST两种融合蛋白，为进一步研究其功能奠定基础。
- 盛彩虹孙毅娜孔杰马绿玥齐蔓莉韩珑那德木刘全忠刘原君
- 关键词：免疫原性
- 蛋白质与DNA相互作用检测的研究进展
- 2019年
- 从细菌到哺乳动物细胞,蛋白质与DNA的相互作用对于所有活体生物均不可或缺。为了执行细胞的生长、分化、分裂以及在受到外界环境刺激时的调节功能,DNA编码的遗传信息必须被精确转录,这对生物的生长、发育与进化极为重要。使用生物技术操纵蛋白质和DNA的相互作用,可调节某些毒力基因的表达,从而有助于疾病的治疗。随着科学研究的深入,越来越多的科学技术被应用蛋白质与DNA相互作用的研究领域。对蛋白质与DNA相互作用研究中常用技术的原理、优缺点及应用进行综述,有助于科研人员在研究中选取适当的方法。
- 张颖刘原君
- 关键词：蛋白质DNA相互作用
- 衣原体致病因子的研究进展被引量：2
- 2018年
- 衣原体是专性细胞内寄生的革兰阴性病原体,具有典型的双相生长周期。在细胞外,衣原体以原体形式(elementary body,EB)存在,具有传染性,但新陈代谢不活跃,而进入宿主细胞后,转化为网状体,新陈代谢活跃,具有复制性[1]。
- 胡春敏孙毅娜刘原君
- 关键词：衣原体致病因子宿主细胞病原体细胞内细胞外
