国家自然科学基金(39770002)
- 作品数：11 被引量：19H指数：2
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- 相关机构：第二军医大学复旦大学中国人民解放军总医院更多>>
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- 纤连蛋白与烟曲霉分生孢子相互黏附作用的初步研究被引量：4
- 2003年
- 目的:初步探讨纤连蛋白(fibronectin,Fn)与烟曲霉分生孢子的相互黏附作用,以及孢子相互黏附作用的关系。方法:利用流式细胞仪检测不同浓度的Fn与烟曲霉分生孢子的黏附率及经不同胰蛋白酶处理后分生孢子与Fn的黏附率的变化;通过共聚焦免疫荧光显微镜观察Fn受体与分生孢子的相互作用及表面形态学变化;通过扫描电镜和透射电镜观察分生孢子静止期细胞壁最外层的形态及孢子在生发膨胀过程中形态学的变化。结果:随着Fn浓度的增加,与分生孢子的黏附率也增加;当用胰蛋白酶预先处理过烟曲霉分生孢子后,定量的Fn与烟曲霉分生孢子的黏附率随着胰蛋白酶浓度的增加而降低;含有荧光的Fn的配体-受体均匀分布在烟曲霉分生孢子表面;静止期和生发膨胀期分生孢子细胞的表面和内部均有特征性的变化。结论:Fn与烟曲霉分生孢子的黏附作用有浓度依赖性和饱和性。静止期分生孢子的表面可表达高水平Fn受体;膨胀过程中表面小棘状突起逐渐脱落;胞壁内没有受体存在;蛋白质破坏性试剂可除去分生孢子小棘状突起。
- 徐赤宇吴建华温海陈江汉徐红孟玉景李小英
- 关键词：纤连蛋白烟曲霉分生孢子
- 新生隐球菌原生质体形成条件的研究被引量：1
- 2001年
- 目的 :研究新生隐球菌原生质体形成的条件。 方法 :应用不同的酶 (溶壁酶和 Novo Zym e2 34 )、在不同的酶浓度 (1、3、5 m g/ml)、p H值 (4、5、6、7、8)以及加入不同的渗透压稳定剂 (蔗糖、甘露醇和山梨醇 )的条件下 ,分别制备原生质体并计算原生质体形成率。 结果 :对数生长早期的细胞较易形成原生质体 ,原生质体形成的最佳条件是以 0 .8m ol/L的山梨醇为渗透压稳定剂 ,p H 6 .0 ,加入 5 m mol/L DTT和 3mg/ml Novo Zym e2 34 ,孵育 75 m in,在此条件下 ,原生质体形成率是 98.1%。溶壁酶与 Novo Zym e2 34的结果相似。 结论 :原生质体分离的关键因素是合适的溶菌酶、p
- 邹先彪廖万清温海吴建华仇芸
- 关键词：新生隐球菌原生质体溶菌酶
- 胰蛋白酶对烟曲霉分生孢子表面纤连蛋白受体的影响
- 2005年
- 目的:应用流式细胞仪(FCM)测定胰蛋白酶(胰酶)对烟曲霉细胞活力的影响,探讨胰酶对烟曲霉分生孢子表面纤连蛋白受体的影响。方法:用流式细胞仪检测经胰酶预处理20min后的烟曲霉分生孢子的活力、纤连蛋白与烟曲霉分生孢子的黏附率及经胰酶处理后的分生孢子与纤连蛋白黏附率的变化,同时应用激光共聚焦显微镜观察分生孢子表面纤连蛋白受体的分布情况。结果:经胰酶预先处理的分生孢子无凋亡峰出现、被干预的分生孢子接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基后仍有大量烟曲霉生长;纤连蛋白与被干预的分生孢子的黏附率随着胰酶浓度的增加而降低;干预后分生孢子表面荧光标记的纤连蛋白受体分布下降。结论:胰酶可降解烟曲霉分生孢子表面相关蛋白受体;流式细胞仪可作为检测烟曲霉分生孢子表面微观变化可靠而高效的辅助手段之一。
- 徐赤宇陈江汉吴建华王溪涛温海
- 关键词：烟曲霉流式细胞仪胰蛋白酶
- 新生隐球菌5种血清型的CAP64基因的序列分析
- 2010年
- 目的多糖荚膜是新生隐球菌的重要的毒性因子,应用荚膜多糖抗原可以进行新生隐球菌的血清分型。方法该研究分析了5种血清型的CAP64基因的序列的相似性,作者扩增了CAP64基因一个约550bp的DNA序列,扩增产物经纯化后克隆到T载体上,转化至大肠杆菌JM109株中,通过聚合酶链反应(PCR)鉴定阳性克隆并测序。结果 5种血清型CAP64序列的比较显示其间的碱基差异为61～91bp,相似性为83.75%～88.03%,其核酸序列的差异是多位点的,主要在227～231bp之间;氨基酸的分析结果与此类似。结论 5种血清型的CAP64基因存在着一定的差异。
- 邹先彪廖万清温海吴建华仇芸杨金水
- 关键词：新生隐球菌
- 烟曲霉分生孢子表面形态改变及纤连蛋白受体分布状态被引量：2
- 2002年
- 目的观察烟曲霉分生孢子静止期及其在膨胀生发过程中表面形态的改变。观察纤连蛋白受体在孢子表面分布状态及其在膨胀生发过程中的变化。方法取培养成熟的烟曲霉,磷酸盐缓冲液冲洗后,通过3.5～4.0μm的钢丝网过滤提取制备纯净分生孢子悬液(108细胞/mL)。加入细胞培养液(RPMI1640+10%FBS),分别在0、2、4、6h取材固定,进行扫描电镜观察。另取定量分生孢子悬液(108细胞/mL)孵育在包被有定量纤连蛋白(50μg/mL)的微量测定细胞培养板中,37℃3h;用磷酸盐缓冲液冲洗3次,再分别加入兔抗人-纤连蛋白抗体和羊抗兔IgG-FITC孵育(37℃1h),胰酶消化后冲洗固定立即送共距焦免疫荧光电镜检查。结果静止期分生孢子表面有特征性的小棘状层形式,即有许多刺猬毛状的突起分布在其表面。孢子膨胀生发过程中,刺猬毛样小棘状层结构逐渐降解脱落,大约4h后完全降解脱落。孢子变成由条索状纤维质构成的光滑细胞壁球体;通过共距焦免疫荧光电镜发现FITC均匀地分布粘附在分生孢子表面刺猬毛样棘状突起上。结论静止期分生孢子的表面可表达出高水平纤连蛋白受体。带有放射荧光标记的纤连蛋白配体-受体均匀地分布在静止期分生孢子最外面小棘状层。孢子膨胀过程中表面小棘状层逐渐脱落。
- 徐赤宇温海吴建华
- 关键词：烟曲霉宿主细胞细胞粘附超微结构
- 一种快速提取新生隐球菌基因组DNA的方法
- 2002年
- 本研究建立了简单快速抽提新生隐球菌基因组DNA的方法,适用于PCR和酶切分析。方法是细胞悬浮于含5mmol/LDTT的1%Sarkosyl抽提缓冲液中,通过加入玻璃珠在混漩器上剧烈振荡破碎细胞壁和荚膜;然后酚氯仿抽提DNA,1×108细胞约可得1μgDNA。
- 邹先彪廖万清温海吴建华仇芸
- 关键词：新生隐球菌DNA
- 侵袭性曲霉病大鼠生化指标的改变及烟曲霉分生孢子致病力研究
- 2004年
- 目的 :观察原发侵袭性曲霉大鼠生化指标的改变 ,探讨烟曲霉分生孢子致病性与其表面小棘状层的密切关系。 方法 :6 0只大鼠随机均分为免疫抑制组和非免疫抑制组。非免疫抑制组分为实验组和对照组 ,分别接种含或不含胰酶的孢子悬液 ;免疫抑制组先注射环磷酰胺和醋酸可的松 ,余处理同非免疫抑制组。观察所有大鼠病理学改变 ,通过内眦静脉采血生化分析、组织器官研磨涂片以及肾脏印模等观察免疫抑制大鼠分生孢子的致病力及菌落生长情况。 结果 :非免疫抑制组无明显病理学改变。免疫抑制对照组病理学损伤较实验组严重。在相同培养条件下免疫抑制对照大鼠的肾脏印模、血液培养、肺组织可观察到的烟曲霉多于实验组。血清 TBIL 和 DBIL 在感染后 8h有一过性升高 ,血清 AL P、GGT、TP和 Alb无显著改变 ,L DH、L DH1、CK、CK- MB在 2 h后即有明显升高 ,8～ 2 4 h达到最高峰 ,为对照组的 3～ 6倍 ,4 8～ 72 h后逐渐下降至正常水平。 结论 :在烟曲霉感染过程中 ,细胞免疫有很重要的作用。用蛋白质破坏性试剂可除去刺猬毛样小棘状层 ,经过胰酶预处理的烟曲霉分生孢子所引起的原发侵袭性曲霉病大鼠病理与其对照组有显著差异 。
- 徐赤宇温海吴建华仇芸陈江汉徐红赵谨
- 关键词：侵袭性曲霉病生化指标致病力
- 新生隐球菌的AFLP分析被引量：1
- 2010年
- 目的评估AFLP-DNA指纹技术在新生隐球菌分类中应用情况。方法新生隐球菌基因组DNA用双酶酶切,双链接头连于其酶切末端,用与接头和酶切位点互补的引物扩增DNA片段,其产物在高分辨的变性聚丙酰胺凝胶上电泳分离,然后进行银染。结果分析来自5种血清型和临床分离株的18株新生隐球菌,可见有30多条大小在30～500bp的DNA-AFLP指纹,相同的血清型有不同的指纹图谱,来自同一患者不同病期的两株分离株和来自同一患者患者的不同部位的两株分离株都显示出相同的带型。结论显示了AFLP的高分辨率,是适用于新生隐球菌流行病学调查的有力工具。
- 邹先彪温海廖万清吴建华仇芸杨金水
- 关键词：新生隐球菌DNA扩增片段长度多态性
- 新生隐球菌基因组DNA不同抽提方法的比较被引量：2
- 2010年
- 目的 DNA是进行分子生物学研究的重要基础。在本研究中,我们建立了2种简单快速抽提基因组DNA的方法并可用作PCR扩增的模板。通过比较4种不同的DNA抽提方法以确定哪种更适合进行下一步的基因分析。方法这4种方法是:玻璃珠法,酶法,3%SDS法和氯化苄法。玻璃珠法是用玻璃珠在混漩器上剧烈振荡破碎细胞壁;3%SDS法是将细胞在含10mmol/LDTT的3%SDS溶液中加热,然后用5mmol/LKAc和异丙醇抽提,DNA的产量通过A260测定。结果 3%SDS溶解法、经典酶法、玻璃珠法和氯化苄法的DNA产量分别为0.4154±0.0367、0.8484±0.0756、1.2636±0.2040、0.4070±0.0339(g/L×108CFU/mL)。结论玻璃珠法是最敏感、重复性好、简单、费用合理的抽提方法 。
- 邹先彪廖万清温海吴建华仇芸杨金水
- 关键词：新生隐球菌DNA抽提
- 新生隐球菌线粒体的快速抽提和电镜观察
- 2002年
- 通过NovoZym2 34酶溶壁和低渗机械振荡破壁相结合 ,应用差速离心法分离并纯化了对数生长期的新生隐球菌线粒体 ,然后从经DNaseI处理的线粒体制备液中分离纯化线粒体DNA ;并对差速离心中所获得的菌体、原生质体、线粒体三部分沉淀进行了透射电镜观察 ,结果均证明了我们所抽提的DNA是纯净的 ,适用于酶切分析和PCR分析研究 ,由此成功地建立了快速有效分离和纯化线粒体DNA的方法。
- 邹先彪廖万清温海吴建华仇芸杨金水
- 关键词：新生隐球菌线粒体DNA超微结构
