山东省自然科学杰出青年基金(Q2008D04)
- 作品数：2 被引量：2H指数：1
- 相关作者：刘吉山沈志强谢金文肖跃强管宇更多>>
- 相关机构：山东省滨州畜牧兽医研究院吉林大学更多>>
- 发文基金：山东省自然科学杰出青年基金更多>>
- 相关领域：农业科学更多>>
- 狂犬病“靶向性”Th表位DNA疫苗的构建与瞬时表达研究被引量：2
- 2012年
- 用RT-PCR扩增BALB/c小鼠P31基因,在不影响氨基酸序列前提下,对序列中461nt NcoⅠ酶切位点进行定点突变;采用定向克隆方法将狂犬病病毒核蛋白、糖蛋白及NS蛋白主要Th抗原表位核苷酸序列替换P31序列中CLIP区域,进行新一轮PCR反应获得带有Kozak调控序列的P31-Th分子,以增加目的基因的表达量,并将含有Kozak序列的P31-Th分子克隆入真核表达载体pCI-neo多克隆位点,通过PCR与限制性内切酶酶切方法进行鉴定;最后将各Th表位表达载体转染COS-7细胞,Western-blot检测目的基因的瞬时表达。测序分析结果表明,BALB/c小鼠P31基因CDS区长648bp,编码215个氨基酸,与Gen-Bank中登录的Ii分子(NM_010545)的核苷酸序列、氨基酸序列均存在多个位点差异;定点突变后获得了P31分子突变体,经PCR及限制性内切酶酶切方法证明,成功构建了携带P31-Th分子的真核表达载体;Western-blot分析证实,各P31-Th分子均在COS-7细胞中获得瞬时表达,且表达的目的产物能够与兔抗P31多克隆抗体发生抗原抗体结合反应。结果表明,作者成功构建了狂犬病病毒主要Th抗原表位的"靶向性"核酸疫苗,为开展在小鼠的免疫学试验奠定了基础。
- 肖跃强管宇谢金文郭广君魏风刘吉山沈志强
- 关键词：定点突变定向克隆
- 狂犬病“靶向性”中和表位DNA疫苗的构建与瞬时表达被引量：1
- 2013年
- 采用RT-PCR获得BALB/c小鼠P41基因,并在不影响氨基酸序列前提下,对序列中461nt NcoⅠ酶切位点进行定点突变;然后采用定向克隆方法将狂犬病病毒糖蛋白主要中和抗原表位核苷酸序列替换P41序列中CLIP区域,进行新一轮PCR反应以获得带有Kozak调控序列的P41-N分子,以增加目的基因的表达量,并将该含有Kozak序列的P41-N分子克隆插入到真核表达载体pCI-neo多克隆位点,通过PCR与限制性内切酶酶切方法进行鉴定;最后将各中和表位表达载体转染COS-7细胞,Western blotting检测目的基因的瞬时表达。测序分析结果显示,BALB/c小鼠P41基因CDS区为840bp,编码279个氨基酸,与GenBank已登录(NM_010545)核苷酸序列、氨基酸序列均存在多个位点差异;定点突变后获得了P41分子突变体,经PCR及限制性内切酶酶切方法证明成功构建了携带P41-N分子的真核表达载体;Western blotting证实各P41-N分子均在COS-7细胞获得瞬时表达,且表达的目的产物能够与兔抗P41多克隆抗体发生抗原抗体结合反应。结果表明,成功构建了狂犬病病毒主要中和抗原表位的"靶向性"核酸疫苗,为开展在小鼠的免疫学试验奠定了基础。
- 肖跃强谢金文李书光魏凤丁壮刘吉山沈志强
- 关键词：BALB定点突变定向克隆
