国家高技术研究发展计划(2012AA022207)
- 作品数：12 被引量：67H指数：4
- 相关作者：喻晓蔚聂尧严伟张伟秦星更多>>
- 相关机构：江南大学中国农业科学院生物技术研究所南京农业大学更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划国家自然科学基金国家重点基础研究发展计划更多>>
- 相关领域：轻工技术与工程生物学化学工程理学更多>>
- 酶制剂在果汁生产中的应用研究进展被引量：13
- 2013年
- 果汁含有丰富的营养物质,是一种重要的饮料。在果汁生产过程中存在着果浆粘度高、压榨率低、澄清难及部分果汁有苦味的问题。近年来的研究和实践表明,使用酶制剂处理工艺是解决上述问题的有效途径。目前在果汁生产中应用的酶制剂有果胶酶、淀粉酶、纤维素酶、氧化还原酶和柚苷酶等,其中以果胶酶的应用最为广泛。重点阐述了果汁生产中果胶酶制剂的来源和应用效果,以及新酶制剂品种的开发情况,并论述了果汁用酶制剂未来的研究重点。
- 秦星张华方张伟张宇宏
- 关键词：果汁酶制剂果胶酶
- KH560修饰的溶胶–凝胶法二氧化硅载体用于脂肪酶的固定化被引量：3
- 2016年
- 以F127为模板剂,采用溶胶–凝胶法制备了环氧硅烷改性剂KH560修饰的二氧化硅(F-560-S),通过TG、FTIR、SEM和N_2吸附–脱附等方法对样品表面性质和结构进行了表征。结果表明,F-560-S表面富含环氧基,且具有较大孔径和比表面积。以F-560-S为载体通过共价结合法固定南极假丝酵母脂肪酶B(CALB),结果表明环氧基和载体形貌共同影响固定化酶固载量和酶学性质。F-560-S对CALB的固载量达到375 mg/g support,为普通Si O_2(U-S)的37.5倍;F-560-S固定的CALB在多种有机溶剂中催化1-苯乙醇与醋酸乙烯酯的反应时,催化转化率普遍高于U-S固定的CALB,热稳定性和操作稳定性均有明显改善,重复使用7次后F-560-S固定的CALB酶活力仍为初始活力的88.3%。
- 宋聪喻晓蔚钱丹孙振忠江波
- 关键词：F127酶固定化
- 宏基因组来源果胶酸裂解酶在毕赤酵母中的表达及应用被引量：1
- 2018年
- 果胶酸裂解酶可用于含果胶废水的处理、纸浆漂白以及棉麻纺织品的生物精炼等。基于高通量宏基因组测序技术,从富含果胶土壤宏基因组中挖掘得到一个果胶酸裂解酶基因pela。将pela连接表达载体p PIC9转化毕赤酵母Pichia pastoris GS115。在3 L发酵罐水平,甲醇诱导10 h后,培养基中果胶酸裂解酶活力达到10.8 U/m L。重组PELA的最适温度为45℃,最适pH为9.0,在pH 7.5~11.0具有良好的稳定性。PELA的比活力为244.12 U/mg,以聚半乳糖醛酸为底物时催化反应的Km和Vmax分别为0.26 mg/m L和488.40μmol/min·mg。EDTA及金属离子Cd^(2+)、Zn^(2+)、Mn^(2+)、Cu^(2+)、Fe^(3+)能够高度抑制酶的活性,1 mmol/L Ca^(2+)和2 mmol/L K^+对酶活力有促进作用。将重组PELA作用于苎麻纤维4 h后,纤维质量损失率达到9.2%,苎麻纤维分散度和白度都明显提高。结果表明从宏基因组来源的果胶酸裂解酶PELA在苎麻脱胶中具有良好的应用潜力。
- 董俊帅秦星张志伟张宇宏张伟
- 关键词：宏基因组毕赤酵母苎麻脱胶
- 长野芽胞杆菌(Bacillus naganoensis)普鲁兰酶在大肠杆菌中的活性表达与分泌调控被引量：16
- 2013年
- 【目的】从长野芽胞杆菌(Bacillus naganoensis)JNB-1中克隆出普鲁兰酶基因并在大肠杆菌系统中表达,通过优化诱导条件和使用化学添加剂提高了胞外酶活。【方法】采用PCR方法,从B.naganoensis基因组中扩增出普鲁兰酶基因pul,构建重组菌E.coli BL21/pET-20b-pul。通过优化,确定优化后的IPTG诱导条件以及甘氨酸、Na+的最佳添加参数。【结果】普鲁兰酶在大肠杆菌中得到有效表达,其相对分子质量为119kDa。在优化后的诱导条件(诱导温度20℃,IPTG终浓度0.4 mmol/L,在菌体OD600至1.2时诱导)下,普鲁兰酶的总酶活达到10.8 U/mL。添加甘氨酸和Na+均能有效促进普鲁兰酶的分泌。在诱导时添加终浓度0.08 mol/L的甘氨酸和0.2 mol/L Na+,胞外酶活提高至8.1 U/mL,是不加任何添加剂的10.3倍。【结论】该重组菌的构建为普鲁兰酶制剂的工业生产提供了有价值的菌株,对化学添加剂促进分泌的研究也为重组酶的高水平胞外生产提供了有效的方法。
- 严伟聂尧徐岩
- 关键词：普鲁兰酶基因克隆和表达化学添加剂
- 重组鱼腥藻脂肪氧合酶定点突变及突变酶酶学性质研究
- 2015年
- 重组鱼腥藻脂肪氧合酶(Ana-LOX)基因来自于Anabaena sp.PCC 7120。利用定点突变技术将Ana-LOX的421位和40位的缬氨酸(Val)突变为丙氨酸(Ala),获得突变体V421A、V40A和V421A/V40A。野生型Ana-LOX在50℃下半衰期为3.8 min。而突变酶V421A和V40A在50℃的半衰期分别为4.4 min和7.0 min。突变酶V421A/V40A的半衰期为8.3 min,与野生型Ana-LOX相比,提高了1.18倍。相对于野生酶,突变酶V421A、V40A和V421A/V40A的比活力分别提高了4.83%、41.58%、80.07%。突变酶的最适反应温度均比野生酶(35℃)高5℃。改造后的突变酶更能适合工业生产的需要,对于实际应用具有重要价值。
- 刁含文张充吕凤霞别小妹陆兆新
- 关键词：脂肪氧合酶定点突变酶学性质
- 采用复合保护剂提高重组普鲁兰酶稳定性被引量：4
- 2015年
- 通过向重组普鲁兰酶(PUL)酶液中添加保护剂和防腐剂以提高其热稳定性及储存稳定性,在不同温度下研究了复合保护剂对酶液的热稳定性影响,并研究了保护剂和防腐剂在常温保藏下对酶液贮存稳定性的影响。结果表明,明胶、甘油、Tween20和Ca2+四种保护剂能显著提高PUL的热稳定性,并通过正交试验得到了效果最佳的复合保护剂配方,即Tween20 2 m L/L,明胶6 g/L,甘油5%,Ca2+0.1 mol/L。在60℃下,添加复合保护剂的PUL酶液保温1 h后的酶活保留率为96.07%,较对照高出85.29%;在55℃,通过添加复合保护剂,半衰期较对照提高了3.27倍。最终在常温保藏90 d后,含有复合保护剂和防腐剂(1 g/L山梨酸钾和1 g/L苯甲酸钠)的PUL酶活保留率高达85.25%,达到了工业保藏的需求。
- 赵伟超聂尧穆晓清张荣珍徐岩
- 关键词：普鲁兰酶保护剂热稳定性
- NH_4^+离子对重组毕赤酵母产华根霉脂肪酶发酵过程的影响被引量：2
- 2016年
- 利用重组毕赤酵母在7 L的发酵罐中进行分批补料高密度发酵,考察不同NH4+质量浓度对毕赤酵母基因工程菌表达华根霉脂肪酶的影响。结果表明,补加(NH4)2SO4溶液维持NH4+质量浓度在7 g/L时华根霉脂肪酶酶活最高,分别是不补加(NH4)2SO4溶液、补加并维持NH4+质量浓度在5 g/L、10 g/L条件下的1.41、1.11、1.08倍,而且在该氮源质量浓度条件下,胞外总蛋白质质量浓度最高,达到5.61 g/L。通过分析不同氮源条件下发酵参数比生长速率、产物比形成速率和底物比消耗速率的差异,发现发酵维持NH4+质量浓度在7 g/L时,产物比形成速率和底物比消耗速率均较高,这与该条件下产酶水平最高相一致。研究结果表明,对毕赤酵母基因工程菌发酵过程中的氮源进行优化,能够明显促进外源蛋白质的表达。
- 赵林水喻晓蔚徐岩
- 关键词：毕赤酵母高密度发酵
- 华根霉细胞总蛋白及膜蛋白双向电泳优化体系的建立被引量：1
- 2015年
- 分别针对丝状真菌华根霉细胞总蛋白和膜蛋白,比较了不同蛋白样品的提取方法及IPG胶条的p H梯度对2-DE结果的影响,获得了较优的双向电泳图谱,通过重复实验及蛋白点匹配分析,确定了不同方法的适用性。分别采用Ready PrepTMProtein Extraction Kit试剂盒和Triton X-100提取细胞总蛋白和膜蛋白,利用p H 3~10非线性IPG胶条,可获得相应蛋白点数较多、分辨度高、较清晰、重复性好的华根霉细胞总蛋白和膜蛋白2-DE图谱。利用PDQuest 8.0.1软件分析,细胞总蛋白重复样品间和膜蛋白重复样品间的蛋白斑点匹配度分别达到87%和94%。该研究为华根霉及其他相关微生物蛋白质组学研究奠定了技术基础。
- 郭月王栋徐岩
- 关键词：华根霉双向电泳总蛋白膜蛋白
- 毕赤酵母分泌表达华根霉脂肪酶(r27RCLC)的糖基化鉴定被引量：4
- 2014年
- 研究了毕赤酵母GS115中能够高效分泌表达的华根霉脂肪酶(r27RCLC)的糖基化情况。运用糖基化抑制剂衣霉素处理表达目的蛋白的毕赤酵母细胞,通过SDS-PAGE比较分析经衣霉素处理后的脂肪酶r27RCLC分泌表达量的变化,结果显示酶的分泌表达受到很大的抑制,说明脂肪酶r27RCLC在表达时候很可能发生了糖基化,且糖基化对其有重要影响。通过生物化学方法,利用内切糖苷酶PNGase F和Endo Hf酶切处理脂肪酶r27RCLC,SDS-PAGE和Western Blot,结果显示r27RCLC未发生糖基化。将样品r27RCLC通过胰蛋白酶酶解等步骤处理,进行MADLI-TOF-MS质谱分析,结果发现MADLI-TOF-MS鉴定结果与内切糖苷酶酶切处理结果一致,进一步证明毕赤酵母分泌表达的华根霉脂肪酶r27RCLC未发生糖基化。
- 杨敏喻晓蔚吴厚军徐岩
- 关键词：毕赤酵母糖基化
- 定点突变提高土曲霉Aspergillus terreus脂肪酶的催化活性被引量：4
- 2018年
- 本研究旨在利用理性设计的方法来提高来源于土曲霉Aspergillus terreus的酸性脂肪酶ATL的催化活力。通过同源比对,选择脂肪酶盖子区域和底物结合口袋域中的位点进行定点突变,得到8种ATL的突变脂肪酶。结果发现,盖子区域突变酶ATLLid与底物结合口袋域突变酶ATLV218W的催化活性显著提高。ATLLid和ATLV218W对底物对硝基苯酚月桂酸酯p-nitrophenyl laurate(p-NPL)的催化活性最高,k_(cat)值较ATL分别提高了39.37倍和50.79倍,k_(cat)/K_m值较ATL分别提高了2.85倍和8.48倍。与ATL相比,ATLLid和ATLV218W的热稳定性略有下降,最适p H为5.0,p H 4.0–8.0具有较好的稳定性,说明突变未对ATL的嗜酸耐酸特性产生影响。通过同源建模模拟及分子对接技术分析底物p-NPL与酶分子间的相互作用,解析了ATLLid和ATLV218W催化活性提高的机理。
- 张晓凤喻晓蔚徐岩
- 关键词：毕赤酵母同源建模定点突变催化活性
