国家高技术研究发展计划(2012AA02A406)
- 作品数：16 被引量：31H指数：3
- 相关作者：胡凝珠胡云章王海漩罗婷段志青更多>>
- 相关机构：中国医学科学院北京协和医学院昆明医科大学兰州大学更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划昆明市科技计划项目艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治专项更多>>
- 相关领域：医药卫生农业科学生物学更多>>
- 恶性疟原虫多表位人工随机重组疫苗M.RCAg-1的中试规模制备与鉴定被引量：1
- 2014年
- 中试规模高效制备恶性疟原虫多表位人工随机重组疫苗M.RCAg-1,并对其免疫原性进行鉴定。20 L培养基规模发酵培养M.RCAg-1的工程菌,产物经高压匀浆破碎后,通过镍琼脂糖凝胶FF层析和琼葡糖凝胶G200HP层析两步分离纯化获得中试M.RCAg-1。将15只BALB/c小鼠随机地平均分为3组(弗氏佐剂组、中试M.RCAg-1与弗氏佐剂配伍组和小试M.RCAg-1与弗氏佐剂配伍组)进行皮下免疫,利用间接Elisa和间接免疫荧光(IFA)技术对3次免疫后小鼠血清中的特异性抗体进行分析。IPTG诱导4 h后发酵结束,菌体产量25 g/L,M.RCAg-1约占菌体总蛋白的24%;经两步柱层析分离纯化后,目的蛋白纯度大于95%,回收率高达53.2%;与弗氏佐剂对照组相比,中试M.RCAg-1和小试M.RCAg-1都能在小鼠体内诱生高水平的特异性抗体应答,其抗体滴度均可达到1∶1 024 000。与此同时,两实验组鼠血清抗体的对疟原虫天然抗原都有识别,其识别水平并无差异(P>0.05)。本研究成功地高效制备出多表位人工随机重组疫苗M.RCAg-1,并在小鼠体内证实其具有良好的免疫原性,为随后进行的M.RCAg-1的临床前研究奠定基础。
- 刘新韦新桂高宇辉王恒
- 关键词：恶性疟原虫蛋白疫苗免疫原性
- 尿苷二磷酸与尿苷三磷酸两种佐剂对HAV抗原及HBsAg诱导小鼠体液免疫应答的影响被引量：2
- 2013年
- 目的探讨尿苷二磷酸(Uridine diphosphate,UDP)与尿苷三磷酸(Uridine triphosphate,UTP)两种佐剂对HAV抗原和HBsAg诱导小鼠体液免疫应答的影响。方法分别在HBsAg(1μg)和HAV抗原(18 EU)中加入不同浓度的UDP和UTP(HBsAg组:UDP和UTP均500μg及1、2、5、10 mg,HAV抗原组:UDP和UTP均500μg及1、2 mg),均经腹部皮下多点注射免疫ICR小鼠(HBsAg组:2针,间隔2周,0.1 ml/只;HAV抗原组:单针免疫,0.2 ml/只),并设空白对照组(生理盐水100μl)、抗原组对照组(HBsAg 1μg;HAV抗原18 EU)、铝佐剂组对照组(铝佐剂300μg)、UDP+铝佐剂复合组(HBsAg 1μg+铝佐剂300μg+UDP 2 mg;HAV 18 EU+铝佐剂300μg+UDP 2 mg)和UTP+铝佐剂复合组(HBsAg 1μg+铝佐剂300μg+UTP 2 mg;HAV 18 EU+铝佐剂300μg+UTP 2 mg),分别于末次免疫后(HBsAg组:第4、8、12和16周;HAV抗原组:第4、8、12周)采血,分离血清,ELISA法检测小鼠血清中抗-HBsAg IgG和抗-HAV IgG水平。免疫18周后,分别取HBsAg组中UDP和UTP最佳浓度组及空白对照组小鼠心脏、肝脏、脾脏、肾脏及肺组织进行病理观察。结果除空白对照组小鼠血清检测不到抗-HBsAg IgG外,其余各组小鼠血清抗-HBsAg IgG及抗-HAV IgG水平均在第8周达到峰值,以后逐渐下降。末次免疫后,UDP及UTP各组抗-HBsAg IgG及抗-HAV IgG水平均高于抗原对照组,差异均有统计学意义(P均<0.05)。HBsAg组UDP+铝佐剂复合组产生的IgG水平明显高于抗原对照组、铝佐剂对照组及UDP和UTP各浓度组(P<0.05);HAV抗原组UTP+铝佐剂复合组产生的IgG水平明显高于抗原对照组、铝佐剂对照组及UDP和UTP各浓度组(P<0.05)。在两种抗原中,UDP和UTP的最佳浓度均为2 mg/只。在设置的浓度范围内,UDP和UTP佐剂均未观察到毒性反应。结论UDP和UTP均能明显增强HBsAg及HAV抗原诱导小鼠的体液免疫应答。
- 王越王丽萍王海漩胡凝珠胡云章
- 关键词：佐剂体液免疫
- 重组EB病毒Zta蛋白的原核表达及纯化
- 2013年
- 目的原核表达重组EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)Zta蛋白,并进行纯化。方法 PCR扩增EBV B95-8株BZLF1n氨基端基因,分别插入pThioHisA和pcDNA3.1载体中,构建重组表达质粒pThioHisA-BZLF1n和pcDNA3.1-BZLF1n。用pcDNA3.1-BZLF1n质粒免疫ICR小鼠,制备抗血清。将质粒pThioHisA-BZLF1n转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,优化诱导表达条件。表达产物经亲和层析后,用肠激酶切割,再经离子交换层析,纯化产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果重组表达质粒经双酶切和测序证明构建正确。表达的重组蛋白相对分子质量约为32 000;IPTG终浓度为0.1 mmol/L,37℃诱导6 h,目的蛋白的表达量最高,占菌体总蛋白的30%以上;重组蛋白以包涵体和可溶性两种形式表达。纯化的重组蛋白相对分子质量约为18 000,纯度大于95%,可与制备的小鼠抗血清发生特异性反应。结论在大肠杆菌中高效表达了重组EBV Zta蛋白,纯化的重组蛋白纯度较高,特异性良好,为EBV相关疾病的早期诊断筛查奠定了基础。
- 孙静傅晶晶蔡泓志施建东石怀生胡云章胡凝珠
- 关键词：EB病毒原核细胞
- 酵母多糖-角鲨烯复合佐剂对甲型肝炎和乙型肝炎抗原诱导小鼠体液免疫应答的增强作用被引量：6
- 2013年
- 目的探讨酵母多糖-角鲨烯复合佐剂对甲型肝炎(简称甲肝)和乙型肝炎(简称乙肝)抗原诱导小鼠体液免疫应答的增强作用,并对皮下和鼻腔接种的免疫效果进行比较。方法将酵母多糖与角鲨烯按一定比例混合,制成复合佐剂,将不同剂量的复合佐剂与HBsAg混合,并设生理盐水对照组、HBsAg对照组、铝佐剂对照组和酵母多糖对照组,均经皮下免疫ICR小鼠1次,分别于免疫后2、4、8、16周,采用ELISA法检测小鼠血清中抗HBsAg IgG抗体水平,筛选复合佐剂的最佳免疫剂量。以复合佐剂的最佳免疫剂量与甲肝抗原混合,并设生理盐水对照组、甲肝抗原对照组、铝佐剂对照组和酵母多糖对照组,均经皮下免疫ICR小鼠1次,分别于免疫后2、4、8周检测小鼠血清中抗甲肝抗原IgG抗体水平。以复合佐剂最佳免疫剂量分别与HBsAg和甲肝抗原混合,并设生理盐水对照组、HBsAg对照组和甲肝抗原对照组,经鼻腔免疫ICR小鼠,共免疫3次,间隔2周,分别于末次免疫后4、8周检测小鼠血清中抗HBsAg和甲肝抗原IgG抗体水平。在试验期间,对小鼠的健康状况进行观察,并对小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏组织进行病理分析。结果酵母多糖-角鲨烯复合佐剂对HBsAg的最佳免疫剂量为2 mg酵母多糖+8μl角鲨烯,该组抗体水平明显高于铝佐剂对照组和酵母多糖对照组(P<0.05);复合佐剂对甲肝抗原也有较好的体液免疫增强作用,抗体水平显著高于铝佐剂对照组和酵母多糖对照组(P<0.05);复合佐剂通过鼻腔免疫,对HBsAg和甲肝抗原的体液免疫应答也有增强作用,但效果不如皮下免疫,甲肝抗原鼻腔免疫效果优于HBsAg(P<0.05)。在试验期内,小鼠均未出现异常反应,各器官均未发生病变。结论酵母多糖-角鲨烯复合佐剂能显著增强甲肝和HBsAg抗原对小鼠的体液免疫应答,免疫效果优于铝佐剂;皮下免疫效果优于鼻腔免疫;在免疫剂量范
- 王丽萍王越王海漩胡云章胡凝珠
- 关键词：酵母多糖乙型肝炎表面抗原甲型肝炎抗原
- 混合培养基模式培养杂交瘤细胞表达单克隆抗体被引量：2
- 2016年
- 采用混合培养基模式将杂交瘤细胞进行减血清悬浮驯化培养,通过优化提高单克隆抗体的表达量,并进行抗体的分离纯化。在杂交瘤细胞悬浮培养优化过程中,最终确定的血清浓度为2%胎牛血清,培养基配比为RPM1640∶SFM4CHO∶Opti CHO(4.5∶4.5∶1),接种密度为3×105cells/m L,采用批次补料流加培养,每2 d流加1次,每次流加量为初始体积的3%,抗体的表达量从原始的84 mg/L提高到168 mg/L。将其进一步在5 L搅拌式生物反应器中进行培养,离心后上清经protein A亲和层析纯化,确定抗体的产量为240 mg/L。
- 黄亚杰朱光凯刘珊赵永强谢波刘道军
- 关键词：单克隆抗体
- 氢氧化锌胶体与三磷酸腺苷二钠联用对狂犬病疫苗诱导小鼠体液免疫应答的增强作用被引量：3
- 2012年
- 目的制备氢氧化锌[Zn(OH)2]胶体,并检测其单独或与三磷酸腺苷二钠(Disodium adenosine tripho-sphate,简称ATP)联用对狂犬病疫苗诱导小鼠体液免疫应答的增强作用。方法采用葡萄糖酸锌作为锌源,与NaOH反应制备Zn(OH)2胶体溶液,对其进行纯化及检测,并进行小鼠急性毒性试验;将不同剂量的Zn(OH)2胶体单独或与不同剂量的ATP联用,与狂犬病疫苗(0.25 IU)混合,免疫ICR小鼠,并设生理盐水对照组和抗原对照组,每组8只,Zn(OH)2和Zn(OH)2+ATP和生理盐水对照组采用单次免疫,抗原对照组分别免疫1、2、3、5次,分别于初次免疫后4、8、12、16周采血,分离血清,检测血清中抗狂犬病病毒特异性IgG抗体水平。结果所制备Zn(OH)2胶体溶液最大吸收波长为213 nm,可观察到明显的丁达尔现象,浓度为6 mg/ml,经光学色差显微镜及扫描电镜观察合格,小鼠急性毒性试验未观察到急性毒副作用。大部分佐剂组抗体水平高于抗原单次免疫组,但均未达到抗原5次免疫组水平;0.27和0.21 mg Zn(OH)2组在初次免疫后8周内有高水平抗体产生;0.27 mg Zn(OH)2组在初次免疫后16周出现抗体水平反弹性升高;0.18 mg Zn(OH)2+1.0 mg ATP组和0.18 mg Zn(OH)2+0.5 mg ATP组在初次免疫后4周内产生的抗体水平较高,之后逐渐下降;2次和3次免疫抗原对照组在初次免疫后8周内,其抗体水平不及佐剂组。结论所制备的Zn(OH)2胶体佐剂单独或与ATP联用均可增强狂犬病疫苗诱导小鼠特异性体液免疫应答,且安全性良好,有望应用于疫苗生产。
- 张浩乌美妮王海漩胡凝珠胡云章
- 关键词：胶体佐剂三磷酸腺苷二钠狂犬病疫苗体液免疫应答
- 两种佐剂甘草酸二铵和苦参素对甲型肝炎病毒抗原诱导小鼠体液免疫应答的影响被引量：6
- 2014年
- 目的探讨两种佐剂甘草酸二铵和苦参素对甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)抗原诱导小鼠体液免疫应答的影响。方法将两种佐剂均按低(100μg)、中(500μg)、高(1 mg)3个剂量,分别与18 EU HAV抗原混合,免疫ICR小鼠,并设生理盐水对照组(生理盐水200μl)、HAV抗原对照组(HAV抗原18 EU)和铝佐剂对照组(HAV抗原18 EU+铝佐剂300μg),共9组,均经腹部皮下多点注射,共免疫1次。分别于免疫后第4、8、12、16周采血,分离血清,采用ELISA法检测抗-HAV IgG抗体水平。免疫后第16周处死小鼠,分别取甘草酸二铵和苦参素最佳剂量组及生理盐水对照组小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏组织,进行病理观察。结果免疫后第4、8、12、16周,除生理盐水对照组外,其他各组小鼠血清中均可检测到抗-HAV IgG抗体,且抗体水平除甘草酸二铵中剂量组和苦参素低剂量组外,均在第8周达峰值;甘草酸二铵各剂量组小鼠的血清抗体水平均明显高于HAV抗原对照组(P<0.05),其中甘草酸二铵低剂量组的抗体水平最高,且在第8周时超过铝佐剂对照组;苦参素各剂量组小鼠免疫后各周血清抗-HAV IgG抗体水平均显著高于HAV抗原对照组(P<0.05),其中苦参素低剂量组抗体水平最高,其抗体水平在第12周达峰值。实验期间,各组小鼠均未出现异常表现,各组织均未发现病理改变。结论甘草酸二铵和苦参素均能明显增强HAV抗原诱导小鼠体液免疫应答的水平,具有成为新型疫苗佐剂的研发价值。
- 王霄罗婷李虹娟段志青王陈芸王海漩胡云章胡凝珠
- 关键词：甘草酸二铵苦参素佐剂体液免疫
- 甲磺酸去铁胺佐剂对甲型肝炎病毒抗原诱导小鼠体液免疫应答的影响被引量：1
- 2014年
- 目的探讨甲磺酸去铁胺（deferoxamine，DFO）佐剂对甲型肝炎病毒（hepatitis A virus antigen，HAV）抗原诱导小鼠体液免疫应答的影响。方法将不同剂量的DFO（0.6、1、4、8mg）佐剂分别与HAV抗原18EU混合，免疫ICR小鼠，并设生理盐水对照组（生理盐水200 μl）、HAV抗原对照组（HAV 18 EU）、铝佐剂对照组（铝佐剂300μg＋HAY抗原18EU）和复合佐剂组（HAY抗原18EU＋DFO1mg＋铝佐剂150 μg），均经腹部皮下多点注射，0.2ml／只，共免疫1次。分别于免疫后第4、8、12、16周，采用间接ELISA法检测小鼠血清中抗-HAV IgG水平，并进行安全性试验。结果除生理盐水对照组外，其他各组小鼠血清在各时间点均能检测到抗.HAVIgG；除DFO 0.6mg组外，抗体滴度均在第8周达峰值；不同剂量DFO组的抗体水平均明显高于HAV抗原对照组，其中DFO4mg和8mg组在8～16周时抗体水平显著高于HAV抗原对照组，且差异有统计学意义（P〈0.05），但与铝佐剂对照组比较，差异无统计学意义（P〉0.05）；在8～16周时，同一时间DFO4mg、DFO8mg和复合佐剂组的抗体水平较高，并能维持较长时间，至第16周时仍能达到与铝佐剂对照组相当的水平。结论DFO佐剂能显著增强HAV抗原诱导小鼠的体液免疫应答，有望开发为一种可替代铝佐剂的新型佐剂。
- 罗婷李虹娟王霄段志青李萍王海漩胡凝珠胡云章
- 关键词：佐剂体液免疫
- 人源miR-185通过靶向恶性疟原虫var基因减弱感染红细胞粘附作用的研究
- 2016年
- 为了探讨人源miR-185对恶性疟原虫vor（pfl1955w）基因表达调控并观察感染红细胞粘附所受到的影响，体外培养293T细胞和恶性疟原虫3D7，构建双荧光素酶报告质粒和表达质粒，再分别利用Lipofectamine2000转染293T细胞和Cytomix电转恶性疟原虫3D7，流式细胞仪检测转染效率，用双荧光素酶报告验证人源miR-185对var（pfll955w）的dbl区域直接调控作用，Q-PCR检测vat（胡1955w）mRNA的表达，细胞粘附实验检测感染红细胞的粘附。结果显示，293T细胞和3D7的转染效率在50％以上，过表达人源miR-185可显著抑制含vat（pfll955w）dbl的荧光素酶基因的表达；在293T细胞和3D7中，人源miR-185能够减少var（pfl1955w）mRNA的含量，并使感染红细胞粘附作用下降了39％。结果表明，人源miR-185对疟原虫var（pfll955w）基因表达有下调作用，进而影响恶性疟原虫的粘附。
- 赵志鹏王振生高宇辉邓唯唯魏春燕王恒
- 关键词：恶性疟原虫MICRORNAS粘附作用
- 以α甘露聚糖肽为佐剂的EV71全病毒灭活抗原黏膜免疫小鼠的抗体应答被引量：4
- 2013年
- 目的肠道71型全病毒灭活抗原（EV71Ag）联合α-甘露聚糖肽（PA）佐剂滴鼻免疫，观察全身免疫应答及持续时间。方法5—6周龄BALB／c雌性小鼠随机分为阴性对照组，阳性对照组，高剂量疫苗组，低剂量疫苗佐剂组和高剂量疫苗佐剂组，每组10只。阴性对照组以PBS滴鼻，阳性对照组以EV71Ag肌注给药，免疫组以EV71Ag单独和不同剂量分别配伍PA滴鼻给药。首次给药后第0、2、3、4、5和6周采集血清及鼻肺灌洗液，ELISA法检测血清特异性IgG抗体水平及鼻肺灌洗液sIgA抗体水平，MTr法检测淋巴细胞增殖，中和抗体实验检测小鼠血清中和抗体水平。结果各滴鼻组小鼠血清中均产生一定水平的特异性IgG抗体，高剂量疫苗佐剂组第三次免疫后其血清IgG（2．477±0．500）可达到阳性对照组（3．040±0．120）的80％，佐剂组体外淋巴细胞增殖率较阳性对照组有显著增高（P〈0．05），各滴鼻组血清中和抗体滴度均〉8。结论EV71全病毒灭活联合仪．甘露聚糖肽佐剂免疫小鼠可诱导全身免疫应答，且α-甘露聚糖肽佐剂可增强其作用。
- 荆晶孙强冯素玲赵兴华廖怡然王冰黎卫平
- 关键词：黏膜免疫EV71特异性IGG抗体
