卫生部科学研究基金(WKJ2004-2-013)
- 作品数：7 被引量：19H指数：3
- 相关作者：司进曹利民朱荫昌叶庆沈关心更多>>
- 相关机构：华中科技大学江苏省寄生虫病防治研究所无锡市第三人民医院更多>>
- 发文基金：卫生部科学研究基金国家重点基础研究发展计划国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 去唾液酸糖蛋白受体单链抗体靶向蜂毒肽的体外抑瘤效应研究被引量：1
- 2006年
- 目的探讨抗去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)单链抗体C1与蜂毒肽(Melittin)重组蛋白C1M靶向抑制肝癌细胞的效果。方法将含C1M/pGC的XL1-Blue转化菌通过IPTG诱导表达。表达产物用Ni2+螯合柱亲和纯化,免疫组织化学技术分析重组蛋白C1M的抗原结合能力,四氮唑盐(MTT)法检测C1M对肝癌细胞株HepG2的增殖抑制作用。结果原核表达质粒C1M/pGC在XL1-Blue中获得有效表达;表达产物以可溶性形式存在;纯化的C1M相对分子量为29.4×103;免疫组化结果表明C1M能有效识别去唾液酸糖蛋白受体,与HepG2(C1M)共培养3d,细胞生长抑制率达92.0%。结论在大肠埃希菌中成功表达C1M,位于C端的Melittin蜂毒肽能有效抑制肿瘤细胞的生长,为体内研究Melittin的靶向抗肝癌效果奠定了基础。
- 曹利民赵晓蓉叶庆雷萍吴砂代维朱慧芬朱荫昌司进沈关心
- 关键词：蜂毒肽重组免疫毒素单链抗体
- 恶性疟原虫FCC1／HN株环子孢子蛋白的原核表达、纯化及其对肝细胞靶向作用的观察被引量：6
- 2006年
- 目的从恶性疟原虫FCC1／HN株基因组中扩增得到环子孢子蛋白(circumsporozoite protein,CSP)的全长编码基因,克隆至原核表达载体pET-32c中进行表达纯化,观察重组环子孢子蛋白对肝细胞的结合能力,探讨其作为原发性肝癌基因治疗的靶向分子的可行性。方法根据恶性疟原虫3D7株环子孢子蛋白的编码序列设计一对引物,利用聚合酶链反应(PCR)技术从恶性疟原虫FCC1／HN株基因组中扩增出CSP的全长编码基因,将其克隆到载体pGEM-T中,通过基因测序加以证实;进一步亚克隆至原核表达载体pET-32c中,在大肠杆菌BL21中用IPTG诱导表达,表达产物用Ni2+螯合柱亲和纯化,采用免疫印迹技术(WB)对纯化的融合蛋白进行免疫反应性检测;采用免疫组化(IHC)技术观察重组环子孢子蛋白对不同组织细胞的结合能力。结果从恶性疟原虫FCC1／HN株基因组中成功扩增到1263 bp的全长CSP基因,该基因在原核系统中经诱导表达出一相对分子质量(Mr)约62×103大小的融合蛋白,表达产物以包涵体的形式存在;通过Ni2+亲和柱纯化获得重组CSP融合蛋白;WB表明,重组CSP融合蛋白能被疟原虫阳性血清特异性识别;免疫组化结果显示重组CSP融合蛋白能够与肝癌和正常肝细胞特异性地结合,与其他组织来源的细胞则未见反应。结论CSP是疟原虫子孢子表面主要的蛋白,重组环子孢子蛋白作为原发性肝癌基因治疗的靶向分子具有一定的潜在应用价值。
- 司进曹利民朱荫昌王晓婷高琪梁幼生
- 关键词：恶性疟原虫环子孢子蛋白肝细胞靶向作用
- ASGPR单链抗体-蜂毒肽融合蛋白的构建及其溶红细胞效应被引量：1
- 2007年
- 去唾液酸糖蛋白受体（asialoglycoprotein receptor，ASGPR）是一种异源低聚物的内吞受体，定位于肝脏实质细胞朝向窦状隙一侧的细胞膜表面，在介导肝脏疾病靶向治疗方面具有潜在应用价值。我们在获得抗ASGPR单链抗体CI的基础上，
- 曹利民朱慧芬赵晓蓉叶庆吴砂李文涵赵晓萍朱荫昌司进沈关心
- 关键词：单链抗体细胞效应融合蛋白去唾液酸糖蛋白受体蜂毒肽肝脏疾病
- 去唾液酸糖蛋白受体H1亚基CRD的原核表达、纯化及特性分析被引量：2
- 2006年
- 目的研究去唾液酸糖蛋白受体H1亚基糖识别区(CRD)在大肠杆菌中的诱导表达,为从噬菌体抗体库中筛选其特异性抗体提供靶分子。方法以pET3-CRDH1为模板设计引物,通过PCR扩增CRDH1基因,采用分子克隆技术将其定向克隆至原核表达载体pET-32c中。将含CRDH1/pET-32c的BL21单菌落接种至LB肉汤培养基中培养,并通过IPTG诱导表达。表达产物经Ni2+螯合柱亲和纯化,采用免疫印迹技术(WB)分析融合蛋白的免疫反应性。结果表达产物经SDS-PAGE在35 kd左右显示条带,符合CRDH1与表达标签融合蛋白的理论值,并证明以包涵体的形式表达;通过Ni2+亲和柱纯化获得的CRDH1重组融合蛋白经WB证实,重组CRDH1融合蛋白能被羊抗人ASGPR血清特异性地识别。结论rCRDH1在原核系统获得高效表达,亲和纯化的rCRDH1具有较强的免疫反应性,为进一步从噬菌体抗体库中筛选特异性单链抗体奠定了基础。
- 乔健黄建萍曹利民司进
- 关键词：去唾液酸糖蛋白受体原核表达免疫反应性
- HSV-TK红色荧光蛋白融合载体在HepG2细胞中的表达被引量：3
- 2005年
- 目的:建立红色荧光蛋白(red fluorescent prote in,RFP)标记的单纯疱疹病毒1型TK基因(Herpessimp lex virus thym id ine k inase,HSV-TK)的基因转移系统,并验证其有效性。方法:以pBLuescript-TK为模板,设计引物,将聚合酶链反应(PCR)扩增到的TK基因克隆到真核表达载体pD sRed2-N1中,获得以红色荧光蛋白为报告基因的重组质粒pD sRed2-N1-TK,利用脂质体转染体外培养的HepG2细胞,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察pD sRed2-N1-TK在细胞中的分布和定位,用RT-PCR方法验证其mRNA和蛋白质的表达。结果:空载体pD sRed2-N1转染组中,HepG2细胞内红色荧光呈弥散分布;重组质粒pD sRed2-N1-TK转染组中,红色荧光集中在细胞核中,随着表达量的增加,红色荧光在细胞核中聚集成团块状,2周后稳定表达于细胞浆中;RT-PCR的结果表明,HSV-TK基因在重组质粒转染组中有表达;丙氧鸟苷(GCV)杀伤效应确证了TK基因表达产物胸苷激酶的活性。结论:pD sRed2-N1-TK融合基因真核表达载体在真核细胞HepG2中获得了表达,细胞所表达的融合蛋白具有TK和RFP的双重活性,可用荧光显微镜直接观察其表达情况及亚细胞定位,为HSV-TK/GCV治疗肿瘤研究提供了实用而又方便的工具。
- 王炜煜曹利民司进王健易继林
- 关键词：融合蛋白质类基因扩增真核细胞
- Tat蛋白转导结构域介导HSV1-TK导入肝癌细胞及其效应
- 2006年
- 目的：探讨HIV-1编码的反式激活蛋白Tat与HSV1-TK融合表达对肝癌细胞的杀伤效果。方法：合成编码HIV-Tat47-57（Tat 11）的2条寡核苷酸单链，两端分别引入BamH Ⅰ和Hind Ⅲ两个酶切位点，退火形成寡核苷酸双链，15％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳判断退火效果；以r-pAs16Dr为模板，通过PCR扩增HSV1-TK基因，定向克隆至原核表达载体pET-32中。将含pET-32c-Tat 11-TK的BL21菌通过IPTG诱导表达，表达产物用Ni^（2＋）螯合柱亲和纯化，免疫组化分析重组蛋白Tat 11-TK的膜结合特性，蛋白印迹技术分析该融合蛋白的穿膜能力，检测和分析TK／GCV、Tat 11-TK／GCV对肝癌细胞株HepG2的杀伤作用。结果：表达产物SDS-PAGE在相对分子质量60700左右显示条带，符合Tat 11-TK与表达标签融合蛋白的理论值，并证明以包涵体的形式表达；通过Ni^（2＋）螯合柱亲和纯化获得的Tat 11-TK重组融合蛋白，经免疫组化证实能结合到肝癌细胞表面，蛋白印迹结果说明Tat 11-TK能有效穿过细胞膜进入HepG2细胞内，同时应用低浓度前药更昔洛韦（GCV，150 μmol／L）能有效抑制HepG2细胞生长。结论：Tat 11-TK在原核系统获得高效表达，具有较强的穿膜能力和前药酶活性。
- 曹利民王炜煜赵晓蓉叶庆雷萍刘静代维朱荫昌司进沈关心
- 关键词：HIV-1TATHSV1-TK蛋白转导肝癌基因治疗
- 去唾液酸糖蛋白受体H1亚单位的表达、纯化及其单链抗体的筛选与鉴定被引量：7
- 2005年
- 目的去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)H1亚单位的重组、表达、纯化及其单链抗体的筛选与鉴定。方法将ASGPRH1亚单位糖识别区基因(CRDH1)定向克隆至原核表达载体pET-32c经IPTG诱导表达,表达产物用Ni2+螯合柱亲和纯化,免疫印迹技术(WB)检测;用纯化的CRDH1对人源噬菌体抗体库进行4轮固相筛选,阳性克隆用表达标记(Trx-His-stag)进行差异筛选。取阳性噬菌体C3感染宿主菌HB2151,37℃振荡培养过夜,终浓度为1mmol/L的IPTG诱导表达,12%SDS-PAGE与Westernblot鉴定以及免疫组化鉴定纯化的单链抗体C3与肝细胞结合的特性。结果CRDH1/pET-32c在原核系统经诱导表达出相对分子质量(Mr)约35×103大小的融合蛋白,以包涵体的形式存在;通过Ni2+亲和柱纯化获得CRDH1融合蛋白;经4轮筛选和差异筛选后,有2株可分泌性表达与CRDH1特异性结合的单链抗体,DNA序列分析表明单链抗体重链基因和轻链基因分别属于人免疫球蛋白VH3家族和VKI家族。噬菌体C3经诱导表达出Mr约28×103大小的融合蛋白,可溶性分泌表达于培养基中;通过Ni2+亲和柱纯化获得单链抗体,ELISA、Westernblot表明单链抗体C3能较好结合rCRDH1,免疫组化显示该单链抗体可与肝癌细胞、肝细胞特异结合。结论成功表达ASGPR并筛选出其人源单链抗体。该单链抗体可与表达的rCRDH1以及肝细胞和肝癌细胞特异性结合,提示对肝脏疾病的靶向治疗有潜在的应用价值。
- 曹利民司进朱荫昌王炜煜赵晓蓉叶庆李文涵朱慧芬沈关心
- 关键词：去唾液酸糖蛋白受体人源噬菌体抗体库单链抗体去唾液酸糖蛋白受体人源单链抗体亚单位H1噬菌体抗体库
