国家重点基础研究发展计划(G2000057005)
- 作品数：34 被引量：251H指数：10
- 相关作者：陈彪王鲁宁盛树力王蓉崔旭更多>>
- 相关机构：首都医科大学宣武医院中国人民解放军总医院首都医科大学更多>>
- 发文基金：国家重点基础研究发展计划中国博士后科学基金北京市自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 老年神经变性疾病蛋白基因研究:3种α-突触核蛋白提取纯化方法的比较
- 2004年
- 目的:用经济、简便、快捷的方法得到大量、高纯度的α-突触核蛋白。方法:将重组的proEXNACP,pGEXNACPH和pTYBNACP质粒分别转入大肠杆菌DH5α,BL21和ER2566细胞进行培养增菌,IPTG诱导产生α-突触核蛋白;超声破碎、离心粗提取得到融合的α-突触核蛋白;分别经Ni-NTAresin,GlutathioneSepharose4B和ChitinBeads纯化,得到α-突触核蛋白。用SDS-PAGE电泳观察纯度、Western杂交检测正确性、用BCA蛋白定量法测定蛋白含量。结果:3种方法均能得到较高纯度的α-突触核蛋白,其中用Ni-NTAresin提取纯化的α-突触核蛋白的纯度最高;蛋白收获量分别是10mg/L,5mg/L和5mg/L;经济耗费和实验的繁简程度没有较大差异。结论:3种方法均可作为α-突触核蛋白的提取方法。
- 李淑婷陈彪
- 关键词：老年神经变性疾病蛋白基因Α-突触核蛋白
- 阿尔茨海默病患者脑神经元存活信号转导的障碍被引量：28
- 2002年
- 目的 探讨阿尔茨海默病 (Alzheimer′sdisease ,AD)患者脑神经元凋亡的可能机制。方法 ( 1)免疫组织化学双染色 :①Tunel标记DNA片段的 3′ OH端 ,用硫酸镍加DAB显色 ,阳性产物呈深蓝色。②免疫组织化学标记神经元 :采用抗生物素蛋白 生物素复合物 (ABC)法 ,DAB显色 ,阳性产物呈棕黄色。 ( 2 )将死后 6h以内取材的AD患者和非AD患者脑海马组织分为两组 ,每组分别取 6例 ,匀浆后用Lowry法进行蛋白定量 ,将总蛋白量相等的样品进行免疫沉淀Western印迹分析。结果 ( 1)AD患者和非AD患者对照组脑组织切片中都存在凋亡细胞 ,但AD患者脑组织切片中单位面积凋亡细胞发生率增加。 ( 2 )AD患者海马组织Akt/PKB ,cAMP应答元件结合蛋白 (CREB) ,磷酸化的CREB表达减少 ,凋亡诱导因子表达增加 ,bcl 2表达减少 ,而bax的表达无明显差异。结论 AD患者海马存在神经元存活信号转导通路障碍 。
- 孟艳许浩王蓉姬志娟于顺周江宁盛树力
- 关键词：阿尔茨海默病脑神经元
- 组蛋白脱乙酰化酶在α-突触核蛋白抑制酪氨酸羟化酶表达中的作用被引量：2
- 2006年
- 目的探讨组蛋白脱乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)参与α-突触核蛋白(-αsynuclein,-αSyn)的过表达抑制酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)的可能机制。方法利用HDAC活性检测试剂盒检测MES 23.5多巴胺能神经细胞系和稳定转染-αSyn的细胞中HDAC的活性差异,应用Western-blot及RT-PCR检测转染-αSyn细胞系中HDAC抑制剂———曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA)对TH表达的影响。结果在转染-αSyn的细胞系中HDAC的活性显著高于未转染组;TSA增加了转染细胞内TH蛋白和mRNA的表达(P<0.05)。结论HDAC参与了多巴胺能神经元中-αSyn抑制TH表达的机制。
- 王雪梅陈彪
- 关键词：Α-突触核蛋白酪氨酸羟化酶帕金森病
- α-synuclein-pEGFP真核表达载体的构建及其在SH-SY5Y细胞中的表达被引量：4
- 2003年
- 为了构建 α-synuclein-p EGFP真核表达载体 ,检测其在 SH-SY5 Y细胞内的表达 ,本研究应用下述方法 :PCR扩增 α-synuclein基因并消除终止密码子 ;PCR产物连入 p GEM T-easy载体 ,经测序确认无误后 ,亚克隆入 p EGFP-N1,构建α-synucle-in-p EGF P真核表达载体 ;Lipofect AMINE法转染 SH-SY5 Y细胞 ;荧光显微镜检测报告基因表达产物 EGFP,原位杂交和免疫荧光细胞化学法检测α-synuclein m RNA及其蛋白表达。结果显示 ,该载体转染 SH-SY5 Y细胞后 ,可在细胞内观察到报告基因和目的基因的表达产物。结论 :α-synuclein-p EGFP真核表达载体构建成功 ,并可在细胞内表达。本工作为今后动态观察研究α-synu-clein致
- 张宇新赵焕英苏月苏玉金赵春礼徐群渊杨慧
- 关键词：Α-SYNUCLEINPEGFP真核表达载体绿色荧光蛋白
- 阿尔茨海默病与NQO1和载脂蛋白E基因多态性关联分析被引量：10
- 2003年
- 目的 探讨NQO1基因C6 0 9T位点突变及其与载脂蛋白 (Apo)E基因相互作用在散发性阿尔茨海默病 (SAD)发病机制中的作用。方法 应用聚合酶链反应 限制性片段长度多态性 (PCR RFLP)方法检测了 92例SAD患者和 10 8例正常老年人NQO1基因和ApoE基因多态性分布特征。结果 NQO1T等位基因和T/C +T/T基因型频率SAD组分别为 5 6 %和 89% ,对照组分别为 4 5 %和 71%。SAD组ApoE2等位基因频率显著低于对照组 (χ2 =3.75 3,P <0 .0 5 ) ,而ApoE4等位基因频率高于对照组 ,但差异无显著意义 (χ2 =1.86 3,P =0 .172 )。同时 ,NQO1T/T和T/C基因型与SAD发病相关不受ApoE基因型影响。结论 NQO1基因多态性与中国汉族人SAD发病有明显关联。NQO1基因可能是中国汉族人SAD发病独立的易感基因。
- 马秋兰杨静芳邵明董秀敏陈彪
- 关键词：阿尔茨海默病NQO1载脂蛋白E基因多态性
- 人酪氨酸羟化酶全长及催化结构域序列表达产物酶活性比较被引量：3
- 2003年
- 采用人的全长酪氨酸羟化酶 c DNA为模板 ,设计特定的引物进行 PCR扩增反应 ,获得编码 N-端缺失 14 1个氨基酸的催化结构域 c DNA片段 ,将其插入谷胱甘肽巯基转移酶融合表达载体 p GEX-4 T-1中 ,构建表达质粒 p GEXTHc,同时构建其全长片段的表达质粒 p GEXTHa。两者分别转化大肠杆菌 BL2 1,以 IPTG诱导可高效表达 ,产物以可溶形式存在 ,经亲和层析纯化后以蛋白酶裂解 ,再经亲和层析分离得到较纯的酶蛋白 ,采用高效液相色谱法 ( HPLC-ECD)检测酶活性 ,结果证明催化结构域活性高于全酶 ,是全酶活性的 2 .
- 熊英杨慧于培兰徐群渊
- 关键词：酪氨酸羟化酶催化结构域融合蛋白表达酶活性
- MES23.5细胞酪氨酸羟化酶的种属来源及其重组酶的活性测定被引量：12
- 2004年
- MES 2 3 5细胞作为研究神经变性疾病的工具 ,是一种杂交瘤性多巴胺能神经元细胞系 ,由大鼠胚胎中脑细胞与小鼠神经母细胞瘤 胶质瘤细胞系N18TG2杂交而成 .其酪氨酸羟化酶 (tyrosinehydroxylase ,TH)的动物种属来源不清楚 .应用反转录聚合酶链反应 (RT PCR)法从MES 2 3 5细胞系中克隆了编码TH的cDNA ;结构分析表明 ,其cDNA编码区由 14 97碱基构成 ,共编码 4 98个氨基酸 ,与大鼠和小鼠TH的同源程度分别为 93%和 10 0 % .该杂交瘤细胞系表达小鼠TH .将该cDNA亚克隆至原核表达载体pGEX 4T 1,经原核细胞表达、亲和层析得到了电泳纯的基因重组小鼠TH(recombinantmousetyrosinehydroxylase ,rmTH) .改良和建立了一种体外分析TH活性的新方法 .活性分析证明 ,纯化的rmTH能催化L 酪氨酸发生加单氧反应生成L 3,4 二羟基苯丙氨酸 (L 多巴 ) .rmTH的表观分子量为 5 6kD ;其酶促加单氧反应的最适pH值为 7 0 .乙二胺四乙酸能显著抑制此酶的活性 ,而亚铁离子能明显增强其活性 .
- 于泓李尧华冯秀丽吴燕川周虹陈彪
- 关键词：MES23.5细胞酪氨酸羟化酶重组酶活性
- α-synuclein-EGFP在体外培养SH-SY5Y细胞中过表达对包涵体形成及线粒体结构改变的影响被引量：9
- 2003年
- 为了观察 α-synuclein-p EGFP真核载体在 SH-SY5 Y细胞内表达状况及其对细胞的影响 ,本研究用 L ipofect AMINE法转染 SH-SY5 Y细胞 ,用荧光显微镜检测报告基因表达产物 EGFP,用荧光免疫细胞化学法检测α-synuclein蛋白表达以及用 H-E染色、光学显微镜观察转基因表达产物在细胞内的积聚 ,电镜观察转基因细胞超微结构形态学变化 ,rhodamine12 3染色、荧光显微镜检测线粒体跨膜电位变化。结果证明 ,该载体转染 SH-SY5 Y细胞后 ,在细胞内同时表达报告基因和目的基因 ;外源基因的表达产物可在细胞内积聚形成包涵体并引起线粒体结构和功能改变。本研究结果提示 ,本实验获得的细胞模型可模拟 Parkinson病发生过程中一些基本的神经病理学特点 ,可为进一步探讨
- 张宇新杨慧蔡青珠帕尔鲁强苏月赵春礼徐群渊
- 关键词：线粒体真核载体包涵体
- 帕金森病诊断技术进展被引量：7
- 2005年
- 帕金森病早期临床表现不典型,但如能早期诊断帕金森病,应用保护性治疗,如应用保护黑质神经元药物等有可能减缓病程进展。结合最近几年国外对本病早期诊断技术的新进展做一综述。单光子发射计算机体层扫描(SPECT)及正电子发射计算机体层扫描(PET)对多巴胺神经元末梢功能的检测是目前诊断帕金森病最敏感的指标。应用磁共振波谱(1H-MRS)测定脑内代谢物的浓度,可以了解脑组织的代谢及神经元的功能改变。同时磁共振成像(MRI)及弥散加权成像(DWI)亦能对早期诊断及鉴别诊断帕金森病起一定的作用。经颅超声成像技术(TCS)是一种新的非侵入性超声成像技术,发现PD患者的黑质(SN)区有回声增强,认为这些回声增强区的性质与SN区的铁含量增高有关。
- 陈怡陈彪
- 关键词：帕金森病
- 帕金森病内科治疗新策略被引量：5
- 2005年
- 目前左旋多巴仍是治疗帕金森病的最有效药物,但所有的治疗措施仍停留在对症治疗阶段,并且长期应用左旋多巴会产生难以纠正的症状波动及异动症。针对帕金森病发病机制的研究热点,多种抗氧化应激、延缓细胞凋亡、改善线粒体功能及持续性多巴胺受体刺激的药物逐渐被应用于对帕金森病的治疗,这些药物有望延缓疾病进程,更好的改善临床症状。
- 樊文辉陈彪
- 关键词：神经保护氧化应激凋亡
