国家自然科学基金(30671965)
- 作品数：7 被引量：23H指数：3
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- 相关机构：北京交通大学安徽医科大学中国疾病预防控制中心更多>>
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- 可表达新型甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白辅助病毒依赖型腺病毒载体的构建
- 2014年
- 根据甲型H1N1流感病毒美国加利福尼亚毒株基因序列(A/California/07/2009(H1N1)),全基因合成甲型流感病毒血凝素(HA)编码基因,利用辅助病毒依赖型腺病毒载体(HDAd)骨架质粒pSC15B,构建可表达HA基因的HDAd/HA DNA分子载体,以磷酸钙法转染293Cre4细胞,与辅助病毒H14连续共感染,获得HDAd/HA载体,并大量制备和纯化,进行形态观察和体外感染的初步鉴定。透射电镜下观察HDAd/HA载体具有典型腺病毒形态;与辅助病毒H14共感染293细胞,RT-PCR检测HA基因有转录,显示成功构建HDAd/HA重组腺病毒载体,为甲型流感病毒体内免疫效果和免疫保护作用的研究奠定实验基础。
- 张梅江彦泽陈念华付远辉乔伟王荷何金生
- 关键词：甲型H1N1流感病毒血凝素
- 辅助病毒依赖型腺病毒载体转基因的体外表达效率被引量：1
- 2010年
- 构建可表达增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)的辅助病毒依赖型腺病毒载体(Helper-dependent adenoviral vector,HDAd),并完成大量制备、纯化和体外表达鉴定。荧光显微镜证实HDAd/EGFP可表达,电镜下观察到经CsCl纯化后的腺病毒的典型形态。分光光度计法测定病毒的浓度为4.0×1012颗粒数(Virus particle,vp)/mL。与可表达EGFP的第一代腺病毒载体(First generation adenoviral vector,FGAd)FGAd/EGFP进行了体外感染和转基因表达效率的比较研究,分别用约2000vp/细胞的HDAd/EGFP和FGAd/EGFP感染A549细胞,流式细胞仪检测EGFP的表达情况。通过相同时间点流式细胞仪分析EGFP的表达情况,可见HDAd/EGFP感染早期的A549细胞较FGAd/EGFP有更高的荧光表达率及更高的表达强度,显示HDAd载体具有转基因瞬时高表达的特性,是一种更有价值的疫苗载体。
- 郑娴娴何金生付远辉徐少华谢灿石长信张梅王小波洪涛
- 关键词：增强型绿色荧光蛋白转基因表达
- 呼吸道合胞病毒分泌型融合蛋白的真核表达和纯化
- 2009年
- 目的研究人呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytial viruse，RSV）分泌型融合蛋白（secreted fusion protein，sV）基因在杆状病毒中的表达及纯化。方法根据编码F蛋白的基因序列设计引物，以PCR方法将F蛋白基因的跨膜区和胞质区核酸序列替换为6×His核酸序列，获得COOH’端带有His标签的重组SF-His蛋白编码基因，利用Bac—to—Bac杆状病毒表达系统，构建可表达sF蛋白的重组杆状病毒，用脂质体Cellfeetine reagent转染sf9细胞，实现sF在sf9细胞中的表达，Ni柱亲和层析纯化sF蛋白。结果成功获得了sF-His编码基因，构建的重组杆状病毒可高效表达sF，Ni-柱纯化后sF的浓度为1．084mg／ml，纯度达90％以上。结论杆状病毒系统是制备sF的有效方法，纯化的sF蛋白为RSV新型疫苗及单克隆抗体和诊断试剂等研究奠定了基础。
- 付远辉魏薇何金生郑娴娴王小波唐倩张梅屈建国洪涛
- 关键词：糖蛋白类
- 人呼吸道合胞病毒融合糖蛋白非复制型重组腺病毒的构建和表达被引量：3
- 2008年
- 目的构建含有A亚型人呼吸道合胞病毒（Human Respiratory Syneytial Virus，RSV）融合糖蛋白（Fusion glycoprotein，F）基因的非复制型第一代重组腺病毒（First generation adenovirus vector，FGAd），并研究F基因在重组腺病毒中的表达。方法利用限制性内切酶Xho I和Hind Ⅲ从质粒pGEM3zf-F中切下目的基因F，克隆至穿梭质粒pShuttle-CMV，再与pAdeasy-1在大肠埃希菌BJ5183中进行同源重组，鉴定正确后，用脂质体法转染293细胞，Western Blot鉴定目的基因表达。结果获得了表达RSVF基因的非复制型重组腺病毒FGAd／F，Western Blot检测到F基因的表达。结论获得一株可表达A亚型RSVF的非复制型重组腺病毒FGAd／F，可用于体内研究观察其免疫效果及免疫保护作用。
- 袁媛何金生付远辉张梅唐倩李栋梁魏薇屈建国洪涛
- 关键词：重组腺病毒呼吸道合胞病毒
- 辅助病毒依赖型腺病毒载体研究进展被引量：7
- 2009年
- 辅助病毒依赖型腺病毒载体(helper-dependent adenoviral vector,HDAd)缺乏所有腺病毒的编码序列,与非复制型的第一代腺病毒载体(first-generation adenoviral vector,FGAd)相比,具有载体免疫原性低、安全、转移容量大和持续表达等特点,现广泛用于遗传性疾病、神经退行性疾病和肿瘤等的基因治疗和特异性靶向治疗研究。本文综述了HDAd构建和应用等方面的研究进展及未来的发展方向。
- 付远辉何金生石长信洪涛
- 关键词：基因治疗
- 真核表达人呼吸道合胞病毒F蛋白的纯化方法被引量：3
- 2008年
- 目的真核表达人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,RSV)融合蛋白(fusion protein,F),并完成蛋白纯化及纯度测定。方法根据编码F蛋白的基因序列设计引物,PCR方法扩增出3′端带His标签的F基因序列,克隆入pGEM-T-easy载体,经核酸序列分析后,进一步克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体,限制性内切酶鉴定,用脂质体Lipofectamine 2000转染COS-7细胞,72h后再用Western blot检测目的蛋白的表达。Ni柱亲和层析纯化COS-7细胞表达的F蛋白,高效毛细管电泳分析纯化后蛋白纯度。结果核酸序列分析证实获得带His标签的RSVF基因序列,没有发生无义突变。转染COS-7细胞后,利用Western blot方法检测到F蛋白的特异性条带,纯度达99%以上。结论初步建立了真核表达RSVF蛋白的纯化方法,为进一步优化RSVF蛋白制备条件及单克隆抗体及诊断试剂等研究奠定了基础。
- 陆燕燕何金生张梅虞结梅谢灿袁媛薛绍礼宋蔚郑娴娴
- 关键词：人呼吸道合胞病毒F基因真核表达纯化
- 可表达人呼吸道合胞病毒融合蛋白辅助病毒依赖型腺病毒载体的构建与制备被引量：11
- 2007年
- 构建可表达A亚型人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytialvirus,RSV)融合蛋白(fusion protein,F)的辅助病毒依赖型腺病毒载体(helper-dependent adenoviral vector,HDAd),并完成大量制备、纯化和F蛋白的体外表达鉴定。将带有CMV启动子序列的F基因亚克隆至克隆载体pSC11,鉴定正确后,克隆至HDAd质粒pSC15B,构建pSC15B/F HDAd重组质粒,PmeⅠ消化pSC15B/F去除原核复制元件及抗性基因,获得HDAd/F DNA分子,经磷酸钙共沉淀法转染293Cre4细胞,16h后感染辅助病毒,收获HDAd/F载体粗提液,随后以HDAd/F粗提液及辅助病毒连续共感染293Cre4细胞直至HDAd/F达到复制极限,同时以可表达β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,LacZ)报告基因的HDAdLacZ载体作为平行对照监测载体复制过程。与辅助病毒共感染293Cre4细胞进一步扩增HDAd/F、CsCl梯度法超速离心制备大量纯化的HDAd/F载体,体外感染293细胞,RT-PCR检测到F基因有转录,Western blot分析表明F蛋白有特异性表达。总之,成功构建HDAd/F载体并在真核细胞中实现表达,为体内免疫学效力试验奠定基础,为研制RSV疫苗提供了一种新方法。
- 杨兵何金生石长信张梅虞结梅谢灿陆燕燕付远辉彭向雷洪涛
- 关键词：逆转录聚合酶链式反应免疫印迹
