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转KAP6.1-GFP-蜘蛛拖丝蛋白基因核心序列4S绵羊成纤维细胞株的筛选被引量：1: 2011年; 【目的】通过体细胞核移植为获得皮肤特异表达蜘蛛拖丝蛋白的绵羊奠定基础。【方法】将pcDNA3.1和带有角蛋白结合蛋白启动子质粒pGM-T-KAP6.1分别用BglⅡ和Hin dⅢ双酶切后连接,再与蜘蛛拖丝蛋白基因核心序列4S连接,最后通过酶切与pIRES2-EGFP质粒连接后构建真核表达载体pIRES2-EGFP-4S;将此载体线性化后,采用脂质体法转染绵羊皮肤成纤维细胞,通过G418筛选获得转基因阳性细胞。【结果】筛选得到转pIRES2-EGFP-4S的阳性细胞。对阳性细胞经体外培养后的检测显示:(1)细胞形态(长梭形)、细胞生长曲线(呈S形)、群体倍增时间(随培养时间增加逐渐缩短)和细胞接种率(细胞贴壁率及存活率在24 h内逐渐升高,并达到最高值125%)等均具有正常绵羊成纤维细胞的生物学特征;(2)阳性细胞经冷冻复苏后具有与新鲜阳性细胞相似的生物学特征;(3)PCR检测结果显示,pIRES2-EGFP-4S在阳性细胞的基因组中整合。【结论】获得具有在绵羊皮肤特异表达,且便于检测的转蜘蛛拖丝蛋白4S的绵羊成纤维细胞株。; 王春生原璐宁方勇吴治昊朴善花安铁洙; 关键词：真核表达载体构建转基因

转Temporin-GFP山羊乳腺上皮细胞株的筛选和鉴定: 2014年; 为了获得山羊乳腺特异表达中国林蛙抗菌肽的转基因细胞株,研究利用前期工作中获得的山羊乳腺特异表达载体Tem-GFP-pBC1转染传代培养的山羊乳腺上皮细胞,并经G418筛选获得转基因阳性细胞。其结果,获得特异表达GFP和抗菌肽基因的转基因阳性细胞;转基因阳性细胞和冷冻复苏的转基因阳性细胞经培养,其细胞形态和生长曲线均正常;经PCR检测Tem-GFP-pBC1已整合入山羊乳腺上皮细胞的基因组中,且与对照组相比,转基因细胞可以检测到Tem-GFP的表达。结果表明,获得了能够在山羊乳腺中特异表达Tem-GFP融合蛋白的转基因阳性细胞。; 王春生张志崇张秋婷朴善花仇雨歌安铁洙; 关键词：中国林蛙山羊乳腺上皮细胞

MSTN基因敲低绵羊成纤维细胞株的筛选被引量：1: 2014年; 为了获得绵羊MSTN基因敲低成纤维细胞株,克隆获得MSTN基因序列构建其真核表达载体;设计合成并筛选3种MSTN基因干涉序列(M1、M2和M3),构建相应的3种RNA干涉载体;将MSTN基因真核表达载体单独或分别与3种RNA干涉载体共转染绵羊成纤维细胞后,分别检测其对MSTN基因表达的干涉效率以获得最佳的MSTN基因RNA干涉载体;将筛选的RNA干涉载体线性化后转染绵羊成纤维细胞,通过筛选获得转基因细胞株。结果显示,成功克隆得到与GenBank中序列同源性为100%的绵羊MSTN基因序列,并获得真核表达载体pcDNA3.1(+)-MSTN;构建获得MSTN基因RNA干涉载体pRNAT-M1、pRNAT-M2和pRNAT-M3;与单独转染pcDNA3.1(+)-MSTN后293GP细胞中MSTN基因的相对表达量相比,转染干涉载体后MSTN基因相对表达量明显下降,其中pRNAT-M1干涉效率最佳;将pRNAT-M1线性化后转染绵羊成纤维细胞并利用G418筛选获得转基因阳性细胞;获得的转基因阳性细胞的细胞形态、生物学特性均呈现正常;PCR检测结果显示,pRNAT-M1已整合到细胞基因组中。上述结果表明,成功获得了MSTN基因敲低的绵羊成纤维细胞株。; 李昊薛超张秋婷王春生朴善花宋红卫安铁洙; 关键词：绵羊成纤维细胞 MSTN基因 RNA干涉转基因细胞

崂山奶山羊硬脂酰-CoA去饱和酶基因(SCD)多态性及其与泌乳性状的相关分析被引量：7: 2013年; 利用直接测序法检测了174只崂山奶山羊泌乳母羊的硬脂酰-CoA去饱和酶基因(stearoyl-CoA desatu-rase,SCD)外显子3及侧翼序列多态性。采用最小二乘方法分析其在崂山奶山羊(Capra hircus)群体中的多态性及其与泌乳性状之间的关联效应。结果如下:在SCD基因外显子3及侧翼区检测到4个SNPs,即E315E/e、E368H/h,内含子3的I346R/r和I355Q/q,其等位基因和基因型频率在样本群中均处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)。其中E315E/e和I355Q/q的分布情况一致,呈紧密连锁关系。SCD基因E315和I355位点的EE/QQ基因型与基因型ee/qq的所有乳成分性状差异显著(P<0.05)或极显著(P<0.01),EE/QQ与Ee/Qq基因型的乳蛋白率、乳密度差异显著(P<0.05),等位基因E/Q为乳成分性状的有利等位基因;各乳成分性状的基因加性效应极显著(P<0.01),显性效应不显著(P>0.05)。E368位点hh基因型与HH和Hh基因型的所有乳成分性状差异显著(P<0.05)或极显著(P<0.01),等位基因h为乳成分性状的有利等位基因;所有乳成分的基因加性效应和显性效应极显著(P<0.01)。I346位点rr基因型的300d产奶量极显著(P<0.01)高于RR基因型,等位基因r为300d产奶量的有利等位基因,但其对乳成分性状的影响不显著(P>0.05)。在不同试验群体中分析SCD基因多态性与泌乳性状的关系,发现F群体中,各突变位点的不同基因型在泌乳性状上的差异显著性较低;而P群体中不同基因型间所有乳成分性状的差异显著较高。本研究表明:SCD基因外显子3及侧翼区检测到4个SNPs,即E315E/e、E368H/h、I355Q/q和I346R/r,其中I346R/r在国内其它奶山羊中尚未发现。等位基因E、h和Q分别为乳成分性状的有利基因,等位基因r为300d产奶量的有利基因,SCD基因在崂山奶山羊样本群中对泌乳性状的效应主要来源于对P育种群的影响。; 王桂芝王金凤秦孜娟王建民赵金山程明王建华; 关键词：崂山奶山羊 SCD 泌乳量乳成分

转Temporin-GFP山羊乳腺上皮细胞株的筛选: 获得山羊乳腺特异表达中国林蛙抗菌肽的转基因细胞株,本研究利用前期工作中获得的山羊乳腺特异表达载体Tem-GFP-pBC1转染传代培养的山羊乳腺上皮细胞,并经G418筛选获得转基因阳性细胞.其结果,获得特异表达GFP和抗菌...; 王春生张志崇张秋婷朴善花安铁洙; 关键词：山羊抗菌肽

转肌细胞特异表达MSTN基因RNA干涉序列的小鼠成纤维细胞株的筛选: 2012年; 为了筛选肌细胞特异表达MSTN基因RNA干涉序列的小鼠成纤维细胞株,研究利用人工合成的小鼠肌肉启动子SP,连接前期工作中获得带有GFP基因的小鼠MSTN基因RNA干涉载体pR-NAT-M1,构建真核表达载体pRNAT-SP-M1,将pRNAT-SP-M1线性化后转染小鼠成纤维细胞并通过300μg/mL G418筛选获得转基因阳性细胞。结果表明:获得的转基因阳性细胞呈现正常的小鼠成纤维细胞的梭形,且在荧光显微镜下呈现出表达绿色荧光蛋白的绿色;转基因阳性细胞的生长曲线呈"S"形;转基因阳性细胞经冷冻复苏后,仍具有正常的细胞形态和增殖特性;PCR鉴定结果显示转基因阳性细胞基因组DNA中整合有pRNAT-SP-M1序列。说明成功获得了转肌细胞特异表达的MSTN基因RNA干涉序列小鼠成纤维细胞株。; 吴治昊薛超安星兰王春生苗向阳安铁洙朴善花; 关键词：小鼠 MSTN基因 RNA干涉成纤维细胞

崂山奶山羊分子系谱的构建及家系遗传特征分析被引量：6: 2011年; 【目的】通过微卫星DNA标记技术对已知系谱记录的试验群体构建分子系谱,验证崂山奶山羊与原有系谱记录的一致性,探讨影响亲权鉴定的因素,摸清家系的遗传特征,为群体的保种和遗传管理提供科学依据。【方法】从25个微卫星DNA标记中筛选出12个高多态性的遗传标记,对已知系谱记录的212只崂山奶山羊,利用Cervus vs 2.0软件进行亲权分析,利用Pedigraph vs 2.2软件构建试验群体的分子系谱,利用Molkin vs 3.0、MEGA4和GeneClass2软件对所构建家系的遗传特征及系统发育关系进行分析。用SPSS vs 16软件对每个位点的排除概率(EP)与多态信息含量(PIC)、期望杂合度(He)、观察杂合度(Ho)、等位基因数(K)等多态性参数的相关性进行分析,分析不同位点数及信息来源对亲权鉴定准确性的影响。【结果】12个微卫星DNA遗传标记的多态信息含量均为高度多态(PIC≥0.5),平均为0.687,平均等位基因数为5.75个,期望杂合度平均为0.730;在父本已知的基础上进行母子亲权鉴定,置信度在95%以上的累积排除概率为0.9998,最终从80个候选母亲、祖母中找出了115个后裔的母亲、祖母,发现3个个体与原有系谱记录不相符,符合度达到98.58%,构建了2个以父系为基础的家系及群体分子系谱图。排除概率与PIC相关系数最大(0.99以上),与K相关系数最小(0.67)。使用8个位点可使CEP2达到99.73%以上。【结论】所选12个微卫星标记可用于崂山奶山羊试验群体的亲权鉴定及分子系谱构建;所构建家系具有较好的遗传基础,家系间及家系内具有较高的遗传变异。; 纪志宾王桂芝王金凤陈珊珊王勇赵金山程明王建民; 关键词：微卫星奶山羊亲权鉴定

UHS-拟蜘蛛拖丝蛋白基因转染小鼠成纤维细胞及其鉴定被引量：1: 2011年; 为了获得转拟蜘蛛拖丝蛋白基因2S的阳性小鼠成纤维细胞,本研究将前期工作中人工合成的拟蜘蛛拖丝蛋白基因2S和克隆获得的小鼠超高硫角蛋白启动子(UHS),与带有IRES序列和GFP报告基因的表达载体连接,构建真核表达载体UHS-2S-pIRES2-EGFP;将UHS-2S-pIRES2-EGFP线性化后,采用脂质体法转染小鼠皮肤成纤维细胞,通过G418筛选获得neo基因抗性阳性细胞。结果表明:(1)成功构建UHS-2S-pIRES2-EGFP;(2)转基因细胞的最佳G418筛选浓度为400μg/mL;(3)筛选获得呈梭形的转基因细胞,对其进行传代培养时,细胞增殖缓慢,细胞未呈现正常细胞的"S"型的生长曲线;(4)PCR检测结果显示,UHS-2S-pIRES2-EGFP载体已经整合到G418抗性细胞的基因组中。; 王春生李晶宁方勇张秋婷梁洋朴善花安铁洙; 关键词：真核表达载体小鼠成纤维细胞转基因

中国林蛙抗菌肽Temporin-1 CEa基因的真核表达载体构建被引量：3: 2012年; 为了建立大量获取中国林蛙抗菌肽的方法,根据GenBank中的中国林蛙皮肤抗菌肽Temporin-1CEa基因的mRNA序列(EU624139)设计一对特异性引物,以提取的中国林蛙皮肤总RNA反转录出的cDNA为模板,将扩增的编码序列与pEASY-T3克隆载体连接获得Tem-T3;利用酶切、连接等分子生物学手段,将GFP基因连入Tem-T3克隆载体,再经酶切获得Tem-GFP片段,并插入真核表达载体pcDNA3.1,最终得到Tem-GFP-pcD-NA3.1重组质粒;利用脂质体转染法将该质粒转入绵羊成纤维细胞,48 h后可在荧光倒置显微镜下观察到GFP的绿色荧光表达;qPCR数据分析显示,与对照组相比,转染Tem-GFP-pcDNA3.1的绵羊成纤维细胞中融合蛋白Tem-GFP的表达量可提高约300倍。本研究为构建Temporin-1CEa基因山羊乳腺特异表达载体提供依据。; 张志崇王春生张秋婷朴善花苗向阳安铁洙; 关键词：中国林蛙抗菌肽

小鼠MSTN基因RNA干涉载体的构建及干涉效率的检测被引量：2: 2012年; 为了筛选小鼠肌肉生长抑制素(MSTN)基因的干涉序列,根据GenBank中小鼠的MSTN基因序列,采用RT-PCR方法克隆获得MSTN基因序列,构建其真核表达载体pcDNA 3.1(+)-MSTN;根据MSTN基因序列设计合成3种MSTN基因干涉序列(M1、M2、M3),并构建相应的RNA干涉载体pRNAT-M1、pRNAT-M2、pRNAT-M3。将构建的真核表达载体pcDNA 3.1(+)-MSTN单独或分别与3种干涉载体共转染293GP细胞,检测干涉载体对MSTN基因的干涉效率。结果表明:试验成功克隆得到与GenBank中的序列同源性为99.91%的小鼠MSTN基因序列,并构建了真核表达载体pcDNA 3.1(+)-MSTN;与转染pcDNA 3.1(+)-MSTN后的293GP细胞中MSTN基因的相对表达量(1.000)相比,转染pRNAT-M1、pRNAT-M2、pRNAT-M3后MSTN基因相对表达量明显下降,pRNAT-M1的干涉效率最高。说明研究成功获得对MSTN基因表达具有明显干涉作用的干涉序列。; 安星兰薛超朴善花苗向阳滕春波安铁洙王春生; 关键词：小鼠 RNA干涉

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国家科技重大专项(2009ZX08008-004B)

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