国家重点基础研究发展计划(2001CB51003)
- 作品数：20 被引量：109H指数：8
- 相关作者：张学光施勤陈永井於葛华邱玉华更多>>
- 相关机构：苏州大学江苏省人民医院苏州第四人民医院更多>>
- 发文基金：国家重点基础研究发展计划江苏省高校自然科学研究项目更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 两种不同的转基因细胞构建体系的比较被引量：1
- 2004年
- 目的:比较目的基因在两种不同表达体系构建的转基因细胞上的表达,选择更好的构建体系。方法:脂质体法将重组真核细胞表达载体pcDNA3/FD-L1导入L929细胞,G418(600μg/ml)筛选抗性细胞株,同时将重组逆转录病毒载体pGEZ-Term/PD-L1与辅助载体共转染293T细胞,包装病毒颗粒,其上清感染L929细胞后,经Zeocin(500μg/ml)筛选抗性细胞。流式细胞仪(FCM)检测目的蛋白在两种细胞膜上的表达。结果:两种体系对目的基因的瞬时表达无明显差别;用pcDNA3构建的转基因细胞膜上目的分子表达稳定性差,表达率低,而用pGEZ-Term构建的则目的蛋白稳定高表达,表达率近100％。结论:两种构建体系均能瞬时表达目的分子,pGEZ-Term表达体系更适于构建长期稳定表达目的基因的转基因细胞。
- 葛彦陈永井施勤孙建军王勤张学光
- 关键词：真核表达转基因细胞
- rhCD40L联合化疗药物对乳腺癌细胞株生物学行为的影响被引量：9
- 2005年
- 为了研究人重组CD40L(rhCD40L)对乳腺癌细胞株MDA-MB-231、MDA-MB-435细胞生物学行为的影响,运用多种细胞生物学、分子生物学方法检测细胞生长、细胞周期、细胞膜分子、凋亡相关基因Bcl-Xl、Bax及趋化因子RANTESmRNA水平的改变,并观察了rhCD40L联合IFN-γ、阿霉素(ADM)对MDA-MB-231细胞增殖的影响。结果发现rhCD40L抑制MDA-MB-435、MDA-MB-231细胞增殖,与剂量呈负相关(P<0.05);两株乳腺癌细胞分别在CD40配基化(ligation)作用48、72h进入G1期细胞阻滞;MDA-MB-231细胞CD54、CD95(Fas)、CD120b等分子表达均显著上调,CD95L(FasL)表达下调(P<0.05);MDA-MB-435细胞CD49e、CD95L、CD120a、HLA-DR等分子有显著性变化。两株乳腺癌细胞经rhCD40L作用4、24h后,RT-PCR半定量Bax/Bcl-Xl的比率、RANTES的表达与对照组相比均上调。rhCD40L联合IFN-γ、阿霉素对MDA-MB-231细胞增殖有较强的抑制作用(P<0.05)。由此表明,CD40信号影响乳腺癌细胞周期及TNF家族成员及MHCII类分子的表达,上调凋亡相关基因Bax/Bcl-Xl的比值和趋化因子RANTESmRNA水平,直接或间接介导抗肿瘤作用。同时,rhCD40L还可增强肿瘤细胞对细胞因子和化学药物的敏感性。
- 施勤陈永井谢芳马泓冰季玉红於葛华王勤葛彦张学光
- 关键词：乳腺癌细胞株IFN-Γ阿霉素抗肿瘤
- 人ICOS基因转染细胞对抗体产生的影响被引量：4
- 2003年
- 利用RT-PCR方法从扁桃体中激活的T细胞,mRNA中扩增出ICOS cDNA,继而将ICOS基因插入到逆转录病毒载体pGEZ-Term中,用脂质体法将重组逆转录病毒载体与两个辅助病毒载体共同转染包装细胞293T,用含有完整病毒颗粒的293T细胞的培养上清转染L929细胞,经Zeocin筛选获得稳定表达ICOS蛋白的L929细胞株;经RT-PCR、流式细胞仪表型检测证实L929基因转染细胞能稳定表达人ICOS蛋白。利用ICOS和CD40L基因转染细胞联合IL-10以及PWM驱动的B细胞体外培养系统,分析了ICOS在B细胞生长及抗体产生中的作用,实验结果表明,ICOS在PWM体外培养体系中,能有效地促进B细胞生长以及协同IL-10增加IgG的分泌。
- 邓忠彬陆长明沈丽琴朱伟徐颖范盘生张学光
- 关键词：逆转录病毒转基因细胞抗体
- 共刺激分子及其在特异性免疫应答中的调节被引量：14
- 2002年
- 特异性免疫应答主要包括抗原递呈、免疫细胞相互作用、免疫效应3个阶段,是一个由多种免疫细胞和分子(膜分子和可溶性因子)参与并受到严格调控及制约的复杂生理过程,它涉及抗原递呈细胞(antigen presenting cells,APC)对抗原的特异性识别及记忆。APC与T细胞等兔疫细胞间相互作用及多种免疫分子构成有序的调控网络。
- 张学光古涛
- 关键词：共刺激分子特异性免疫应答共刺激信号免疫球蛋白免疫调节
- 鼠抗人OX40功能性单克隆抗体的研制及其生物学特性的鉴定
- 2005年
- 目的:研制功能性鼠抗人OX40单克隆抗体。方法:以转人OX40的转基因细胞L929-OX40为免疫原,常规免疫6-8周龄的雌性BALB/c小鼠;采用B淋巴细胞融合技术,将免疫小鼠脾脏细胞与SP2/0融合,以L929-OX40转基因细胞及PHA活化的T细胞为抗体筛选阳性细胞,经免疫荧光标记分析对杂交瘤进行反复筛选和多次的克隆化培养;采用快速定性试纸法及竞争抑制结合试验分析了该单抗的亚类及抗原识别位点;采用MTT法分析单抗在体外对T细胞的促增殖效应以及ELISA分析活化T细胞分泌的细胞因子。结果:获得1株持续、稳定分泌鼠抗人OX40单克隆抗体的杂交瘤细胞株(命名为7E11),该单抗能特异性地识别人OX40分子和介导有效的共刺激信号,体外促进活化的T细胞增殖和细胞因子的分泌。结论:成功研制成一株能分泌功能性鼠抗人OX40单克隆抗体的杂交瘤,该抗体特异性地识别人OX40分子并具有在体外协同刺激T细胞的作用。
- 孙建军王勤陈永井居颂文邱玉华施勤于葛华时文彪张学光
- 关键词：OX40杂交瘤单克隆抗体T细胞
- 5株鼠抗人CD28单克隆抗体的研制及生物学特性的研究被引量：12
- 2005年
- 目的:制备鼠抗人CD28分子功能性单克隆抗体,研究其对T细胞活化、增殖及信号转导等方面的生物学效应。方法:以天然高表达CD28分子的人多发性骨髓瘤细胞株U266和小鼠淋巴瘤细胞转人CD28基因细胞株CD28-T分别作为免疫原和检测细胞株,采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行单抗的研制;以快速定性试纸法鉴定单抗亚类;腹水诱生法和免疫亲和层析法进行单抗的制备和纯化;经间接免疫荧光法分析单抗对不同细胞膜表面CD28分子的识别;采用竞争抑制法分析单抗识别的抗原位点;利用3H-TdR掺入法分析单抗对PBTC的刺激效应和免疫荧光法分析PBTC活化前后的表型变化。结果:成功获得5株鼠抗人CD28功能性单克隆抗体,分别命名为2D5、2F5、3B6、3F8和8G8,其中2D5为IgG2a亚类,其余均为IgG1亚类;流式细胞仪分析结果显示,5株单抗均能良好识别CD28-T、U266、XG1和Jurkat细胞表面的CD28分子;竞争抑制试验表明,2D5和8G8能完全阻断标准抗人CD28单抗与U266膜CD28分子的结合,其余3株为部分阻断;3H-TdR掺入法实验结果表明,单抗8G8联合激发型CD3单抗能明显促进PBTC的增殖,刺激指数为7.4,活化细胞CD4、CD25、ICOS、41BB及OX40分子的表达上调。结论:5株单抗均为抗人CD28单克隆抗体,具有重要的基础研究及潜在的临床应用价值。
- 孙中文陶然陆艳红石云杰於葛华邱玉华张学光
- 关键词：CD28杂交瘤单克隆抗体增殖效应协同刺激分子
- 人PD-1基因克隆及其在L929基因转染细胞上的表达被引量：3
- 2006年
- 目的克隆人PD-1基因,构建含有该目的基因的重组逆转录病毒载体,并转染入L929细胞,获得稳定高表达PD-1分子的L929细胞。方法用PCR法从pGEX-5X-3-PD-1扩增出PD-1基因,通过双酶切(PstI BamHI)装入逆转录病毒载体pGEZ Term中,脂质体法共转染包装细胞293T,用含有完整病毒颗粒的293T细胞的培养上清感染L929细胞,72 h后,加入Zeocin进行筛选,挑选出能稳定表达PD-1分子的L929细胞株。结果成功克隆了人PD-1基因,构建了含PD-1基因的重组逆转录病毒载体,包装出具有感染能力的重组PD-1逆转录病毒,筛选出具有稳定表达人PD-1分子的L929基因转染细胞。经流式细胞仪检测:PD-1分子在L929基因转染细胞中具有高表达,达到97.6%。结论构建了含人PD-1基因重组逆转录病毒的载体,筛选出稳定表达人PD-1分子的L929细胞株。
- 明志君肖淑宁陈永井施勤张学光
- 关键词：逆转录病毒
- 人Blys转染细胞对B细胞功能的影响被引量：1
- 2005年
- 利用RT-PCR方法从经IFN-γ激发的正常人外周血单核细胞总RNA中扩增出全长BlyscDNA,继而将BlyscDNA插入真核表达载体逆转录病毒载体pSIV1中。以脂质体转染法将重组逆转录病毒载体与两个辅病毒载体共转染包装细胞293T,将含完整病毒颗粒的上清转染小鼠成纤维细胞L929,经G418筛选获得稳定表达Blys分子的L929细胞;RT-PCR和流式细胞术检测证实Blys分子在L929的稳定和高水平表达。继而以该转染细胞与PWM驱动的人扁桃体B细胞共培养,体外实验表明Blys介导的共刺激信号能促进该培养体系B淋巴细胞增殖,与抗μ抗体信号协同能刺激B细胞分泌IgG。
- 徐海燕於葛华刘琳郑路李文香施勤邱玉华张学光
- 关键词：BLYS转染细胞增殖
- 人PD-L1(B7-H1)基因克隆及其逆转录病毒载体的构建和稳定表达被引量：14
- 2003年
- 目的 :克隆人PD L1(B7 H1)基因 ,并构建含有该目的基因的重组逆转录病毒载体 ,获得稳定表达PD L1基因的L92 9细胞。方法 :从人心脏cDNA文库中扩增出PD L1基因 ,通过双酶切装入逆转录病毒载体 pGEZ Term中 ,脂质体法共转染包装细胞 2 93T ,用含有完整病毒颗粒的 2 93T细胞的培养上清感染L92 9细胞 ,72h后 ,加入Zeocin进行筛选 ,挑选出能稳定表达PD L1蛋白的L92 9细胞株。结果 :构建了用于表达的含PD L1基因的重组逆转录病毒载体 ;经转染包装细胞 2 93T后 ,包装出具有感染能力的重组PD L1逆转录病毒 ;经RT PCR、流式细胞仪表型检测表明 ,筛选出的L92 9转基因细胞能稳定表达人PD L1蛋白。结论 :构建了含人PD L1基因重组逆转录病毒载体和稳定表达人PD L1蛋白的细胞株 ,为该基因功能的后续研究和单克隆抗体的研制奠定了基础。
- 陈永井施勤葛彦徐宽枫古涛孙建军李文香张学光
- 关键词：PD-L1基因克隆逆转录病毒载体
- Graves病甲亢患者细胞因子/可溶性受体测定及其意义被引量：2
- 2003年
- 目的 研究Graves病(GD)甲亢患者外周血细胞因子及其可溶性受体水平的变化,并探讨其在Graves病免疫病理中的意义。方法 应用夹心酶联免疫吸附法(ELISA)动态检测了40例GD外周血中白介素-2(IL-2)、白介素-15(IL-15)、可溶性白介素2受体(sIL-2R)、白介素-6(IL-6)和可溶性白介素6受体(sIL-6R,包括sgp130、sgp80)水平变化,并且随访其中20例治疗后缓解者。结果 与正常对照组相比,治疗前初发GD患者外周血细胞因子及其可溶性受体水平异常改变,经治疗后细胞因子及其可溶性受体水平与临床转归密切相关,但细胞因子水平恢复滞后于临床缓解。结论 T细胞生长因子IL-2/IL-15的失平衡参与GD的免疫病理过程,可溶性受体sIL-2R和sIL-6R可作为其病情变化的监测指标。
- 陈蕾李廷陈尔旦吴敏朱华亭殷昌硕张学光
- 关键词：GRAVES病甲状腺机能亢进症细胞因子可溶性受体
