安徽省自然科学基金(050430303)
- 作品数：9 被引量：19H指数：3
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- 红色糖多孢菌C-12羟基化酶基因eryK的克隆及原核表达
- 2008年
- 目的:探讨红色糖多孢菌C-12羟基化酶基因eryK在大肠杆菌中的最佳表达条件。方法:将eryK基因克隆到表达质粒pET-22b(+),使其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,并对装液量、接种量、诱导时间、IPTG浓度和FeC l3浓度等表达条件进行优化。结果与结论:SDS-PAGE电泳显示,在相对分子质量44×103处有EryK蛋白条带,其含量占菌体总蛋白的58%以上。证明高GC含量的红色糖多孢菌C-12羟基化酶基因EryK可以在大肠杆菌BL21(DE3)中高效地表达,为体外研究EryK酶学相关性质以及大规模发酵奠定了基础。
- 赵皓黄训端张部昌孔小卫张书祥查向东
- 关键词：红色糖多孢菌
- 链霉菌自动调控因子的研究进展被引量：3
- 2007年
- γ-丁酸内酯自动调控因子是一种由链霉菌产生的被称为微生物"激素"的小分子化合物,它控制着链霉菌次级代谢物的产生或形态分化。根据该类自动调控因子C-2位细微的结构差别分为三种类型,分别为A因子型、VB型和IM-2型。本文详细介绍了每种类型中具有代表性的自动调控因子、受体及其对链霉菌次级代谢与形态分化的调控作用,并系统地阐述了其调控网络。
- 吴杭张部昌马清钧
- 关键词：链霉菌受体调控网络
- 大环内酯类抗生素糖基合成及生物学功能被引量：8
- 2007年
- 大环内酯类抗生素结构中的糖基基团在抑菌、生产菌自我保护和调控大环内酯类抗生素内酯环合成方面有着重要的生物学功能。了解糖基的合成途径、糖基转移酶的结构特点和糖基生物学功能对研制新结构抗生素,解决当前日益严重的致病菌耐药性问题起着重要的指导作用。通过基因工程的方法改造糖基,已经合成了一系列具有抗菌活性的新结构化合物。本文就目前所了解的糖基合成途径、糖基转移酶的结构特点和糖基重要生物学功能做一综述,并简单介绍基因工程改造糖基合成新结构抗生素的研究进展。
- 曹孟婵张部昌
- 关键词：大环内酯类抗生素生物学功能
- 产红霉素C的糖多孢红霉菌A226G^-突变体的构建被引量：4
- 2008年
- 糖多孢红霉菌eryG基因编码产物为红霉素3"-O-甲基转移酶(EryG),失活eryG基因能阻断红霉素A的生物合成,积累其中间产物红霉素C。以糖多孢红霉菌A226基因组DNA为模版,用重叠PCR方法扩增出eryG基因两侧约1600bp DNA片段(ΔG),其中去除了EryG上S-腺苷甲硫氨酸结合区域对应的290bp DNA片段。将该片段克隆于质粒pWHM3,构建了同源重组质粒pWHMΔG。PEG介导原生质体转化法将pWHMΔG转入糖多孢红霉菌A226中,通过染色体同源重组突变染色体上eryG基因。利用薄层层析、PCR和质谱方法筛选出一株eryG基因突变的糖多孢红霉菌A226G-突变体,此突变体主要积累中间产物红霉素C而不再合成红霉素A。通过eryG基因的功能补偿,糖多孢红霉菌基因工程菌A226G-G+可以恢复红霉素A的合成能力。
- 袁华黄训端张部昌刘道琴赵皓孔小卫张书祥
- 关键词：糖多孢红霉菌红霉素同源重组
- 一种新的链霉菌表达载体启动子(英文)
- 2007年
- eryA基因直接控制着红霉素母环6-脱氧-红霉内酯B的合成,在红霉素生物合成过程中具有重要作用。本文克隆了eryA基因的启动子PeryA,以绿色荧光蛋白基因为报告基因,构建了大肠埃希菌-糖多孢红霉菌穿梭型质粒。PEG介导原生质体转化法将穿梭型质粒分别转入糖多孢红霉菌A226与变铅青链霉菌JT46,荧光显微镜检测发现,此启动子在两菌株中都具有功能。随后,以变铅青链霉菌JT46为宿主,对PeryA启动子区域进行了深入研究,结果发现该启动子的-35区并不是必需的,仅有-10区、长度为41bp的该启动子在链霉菌中仍具有功能。定点突变证明-10区对于该启动子是必不可少的。因此,41bp的该启动子片段可作为链霉菌的有效启动子,这是迄今为止所发现的最短的启动子之一,可用于构建新的链霉菌表达载体。
- 吴杭张部昌查向东孔小卫马清钧
- 关键词：启动子糖多孢红霉菌变铅青链霉菌增强型绿色荧光蛋白
- 产红霉素B红色糖多孢菌突变体的构建(英文)被引量：1
- 2009年
- 目的:获得大量红霉素合成中间产物红霉素B,并进一步研究eryK基因的活性位点。方法:通过重叠PCR将eryK基因中包括BC环在内的关键氨基酸序列删除,克隆到同源重组质粒pWHM3上,继而通过染色体同源重组方法将EryK羟基化酶基因失活,构建了缺失C-12羟基化酶活性的红色糖多孢菌突变体。结果与结论:构建了红色糖多孢菌突变菌株AK17,对发酵产物进行TLC和MS分析,结果显示突变体主要合成红霉素B。
- 赵皓董翔张部昌袁华黄训端张书祥
- 红色糖多孢菌表达载体pZW的构建
- 2007年
- 目的:对红色糖多孢菌染色体整合型表达载体pZMW进行改进,以提高表达载体稳定性和表达外源基因效率。方法:以pSET152和pET-22b(+)为出发质粒,用PCR方法从红色糖多孢菌染色体DNA上扩增红霉素抗性基因启动子PermE作为表达载体启动子,并利用pSET152质粒上链霉菌染色体整合位点(attP)和安普霉素抗性基因,构建了红色糖多孢菌表达载体pZW。结果:与pZMW相比,pZW表达载体只有1个大肠杆菌质粒复制子,质粒减小2 530 bp,同时在链霉菌属细菌和红色糖多孢菌中能够表达硫链丝菌肽抗性基因(thio)和荧光蛋白基因(EGFP)。结论:pZW质粒能够在链霉菌属细菌和红色糖多孢菌中稳定表达外源基因。
- 魏魏张部昌袁华赵皓彭惠
- 关键词：红色糖多孢菌红霉素
- 红霉素3"-O-甲基转移酶基因eryG克隆及表达被引量：1
- 2008年
- 目的:探索红色糖多孢菌红霉素eryG基因在大肠杆菌中的最佳表达条件。方法:以红色糖多孢菌总DNA为模板,PCR扩增出eryG基因序列,克隆到原核表达载体pET-22b(+)上,并使其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。从诱导剂IPTG的终浓度和诱导时间两个因素来优化eryG基因的表达条件。结果:eryG基因可以在大肠杆菌中表达,表达产物EryG经SDS-PAGE分析相对分子质量约为33×103。表达条件经优化后,重组蛋白EryG表达量占菌体总蛋白的55%以上。结论:红色糖多孢菌红霉素eryG基因可以在大肠杆菌中高效地表达,为进一步研究EryG的相关酶学性质、分析其对红霉素发酵产物的影响奠定了基础。
- 袁华张部昌赵皓孔小卫黄训端查向东张书祥
- 关键词：红色糖多孢菌红霉素
- 红色糖多孢菌A226-YA突变体构建及产物分析被引量：4
- 2006年
- 目的:用红色糖多孢菌(前称糖多孢红霉菌)KR6突变体合成酮内酯类化合物3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B,同时,KR6突变体不合成红霉素。方法:以红色糖多孢菌A226基因组DNA为模板,用重叠PCR技术扩增KR6酶域中Tyr2699密码子TAC突变为A la密码子GCC的1 000 bp DNA序列,克隆到载体pWHM3上构建同源重组质粒pWHM3-YA。将pWHM3-YA转化到A226中,并整合到红霉素合成基因座,经染色体二次重组后筛选TAC突变为GCC的突变体A226-YA,再进行突变体A226-YA产物分析。结果:通过染色体同源重组,构建了红色糖多孢菌突变菌株A226-YA,Zabspec Fab质谱分析结果显示A226-YA突变体合成了3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B,而没有检测到红霉素。结论:突变Tyr2699能有效失活KR6,但3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B的产量较低。
- 曹孟婵张部昌马清钧
- 关键词：红色糖多孢菌聚酮合成酶
