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γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因调控的初步研究被引量：1: 2006年; 目的研究抗氧化基因———大鼠γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)基因的功能区及其调控表达。方法克隆1.76 kb大鼠γ-GCS基因的重链亚单位———GCLC基因的上游调控序列,并构建含荧光素酶基因的报道载体GCLC-Luc(GCLC/pGL-3)。利用嵌顿缺失方法构建GCLC基因的缺失体,并将其表达载体转染大鼠肺泡上皮细胞,在细胞中分析该基因的调控区域。通过该方法初步发现GCLC基因的上游调控序列的-745^-705 bp属负性调控区域。利用EMSA和supersh ift证实大鼠肺泡上皮细胞GCLC基因负调控区域的E-box元件能与转录因子USF1/USF2特异性的结合。将USF的真核表达载体和逆转录病毒表达载体分别导入肺泡上皮细胞,观察GCLC基因的转录活性和GCLC蛋白的表达情况。结果GCLC基因的-403^-111 bp和-705^-613 bp区段属正调控区域;-745^-705 bp属负调控区域。EMS和supersh ift证实上游刺激因子(USF)能与该负调控区域的E-box元件结合抑制GCLC基因的转录和表达。结论发现GCLC基因其中2个正调控区域(-403^-111 bp与-705^-613 bp)和1个负调控区域(-745^-705 bp),其中负调控区域-745^-705 bp上的E-box元件通过与USF结合介导GCLC基因的负性表达调控。; 程璘令李冰涂洪斌刘启才冉丕鑫; 关键词：慢性阻塞性肺病 Γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶氧化应激

联合利用嵌套缺失和酚筛选法构建和鉴定目的基因的缺失突变体: 2006年; 目的介绍一种快捷、无突变的目的基因缺失体构建和鉴定方法。方法用MluI和SacI酶将GCLC/pGL3在GCLC基因与pGL3连接处切开,形成以GCLC端为3’凹端而pGL3载体端为3’凸端的线型载体。利用外切核酸酶Ⅲ从GCLC基因端(3’凹端)单向逐一切除GCLC基因上的核苷酸,并在不同的时间终止其反应以获得一系列的GCLC基因缺失体。将GCLC基因缺失体与pGL3载体自身环化构建成GCLC基因序列缺失体的pGL3报道载体。最后用酚抽提和凝胶电泳法粗略挑选出不同长度的GCLC/pGL3缺失突变体。结果利用嵌套缺失法构建出各种长度的GCLC基因的缺失突变体,且不存在基因突变的现象。利用酚筛选法快速鉴定出29种不同长度的缺失突变体。结论联合利用嵌套缺失和酚筛选法可以高保真而快速地构建和鉴定目的基因的缺失突变体。; 程璘令李冰涂洪斌刘启才冉丕鑫; 关键词：缺失突变体

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广东省自然科学基金(06301136)