国家自然科学基金(30740032)
- 作品数：9 被引量：30H指数：4
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- 程序性坏死参与铝致神经母细胞瘤细胞死亡机制被引量：7
- 2008年
- 目的探讨程序性坏死(necroptosis)在铝致神经细胞死亡中的作用,以完善铝致神经细胞死亡的机制研究。方法用4mmol·L-1AlCl3·6H2O染毒神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y制作铝致神经细胞死亡模型,用RNA干扰技术(RNAi)抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)3基因的表达;用程序性坏死的特异性阻断剂necrostatin-1(Nec-1)抑制程序性坏死的产生。检测不同处理、处理后不同时间点细胞的活力变化,荧光定量PCR法检测RNAi效率,流式细胞仪检测细胞的凋亡率及坏死率改变,免疫组织化学法检测蛋白表达量的差异。结果通过细胞活力在不同小干扰RNA(siRNA)序列、不同转染剂量、不同作用时间点的变化,找到其最适转染浓度为10nmol·L-1,最适作用时间为转染后48h。通过RNAi抑制caspase 3基因表达的差异,筛选出最有效序列为caspase 3 siRNA1序列;荧光染色并观察计数表明caspase 3 siRNA的转染效率为93.0%,其干扰效率为63.0%,对caspase3蛋白表达有显著的阻抑效应。Caspase 3 siRNA单独作用于染铝SH-SY5Y细胞,可以显著提高细胞活力,降低其凋亡率;Nec-1单独作用于染铝SH-SY5Y细胞可以显著提高其细胞活力,降低细胞坏死率;共同作用在染铝SH-SY5Y细胞时两者有增强作用,可以显著提高细胞活力,并同时降低SH-SY5Y细胞的凋亡率及坏死率。结论在铝致神经细胞死亡的机制中,除了传统上认为的凋亡和坏死途径外,还有程序性坏死的存在。
- 张勤丽牛侨张玲王亮
- 关键词：程序性坏死半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3细胞死亡
- bak基因干扰在铝致SH—SY5Y细胞凋亡中的作用
- 2008年
- 目的以铝致神经母细胞瘤细胞（SH—SY5Y）为模型，研究用RNA干扰的方法阻抑bak基因的表达，找到其最优的序列、最适的转染浓度和转染时间，以减少铝引起的神经细胞凋亡。方法将三对bak基因小干扰RNA（siRNA）序列用不同浓度铝染毒细胞，分别测定不同的siRNA序列、不同的转染浓度及不同的转染时间对细胞活力的影响。用荧光染色法计数转染效率，用荧光定量PCR法检测干扰效率，用免疫组织化学染色法测定阻抑Bak蛋白表达效果。最后，用选定的bak siRNAl作用于染铝后的神经瘤细胞，并检测其对细胞的凋亡率及坏死率的影响。结果siRNAI序列为最有效的序列，最适转染浓度为10nmol／L，最适作用时间为转染后24h。siRNA的转染效率〉90％，最大干扰效率为57．76％，并表现了对Bak蛋白表达的明显的阻抑效应。bak siRNAI作用于染铝后的神经瘤细胞，可以明显降低细胞的凋亡率，但对细胞的坏死率的影响并不明显。结论凋亡是铝致SH-SY5Y细胞死亡的重要途径，针对bak基因，用化学法合成siRNA并将其导人神经细胞，可以有效降低bak基因和Bak蛋白的表达，提高细胞活力和降低细胞的凋亡率，为预防及治疗铝诱导的神经细胞凋亡及神经退行性变的发生发展提供理论依据。
- 张勤丽牛侨牛丕业
- 关键词：BAK基因RNA干扰铝细胞凋亡
- Nec-1对铝作用下神经细胞活力及凋亡、自吞噬基因的影响被引量：2
- 2010年
- [目的]研究坏死性抑制剂Necrostatin-1(Nec-1)对铝(Al)作用下的神经细胞活力及凋亡、自吞噬基因的影响。[方法]体外原代培养小鼠神经细胞,通过2mmol/L Al3+作用于神经细胞制造铝损伤模型,加入不同剂量的Nec-1,用细胞活力检测(CCK-8)和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的方法观察Nec-1对染铝神经细胞的作用。[结果]细胞活力检测:以2mmol/L Al3+染毒组作为对照,30μmol/L Nec-1组的细胞活力与对照组比较,差别有统计学意义(P<0.05),60、90μmol/L Nec-1组与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。RT-PCR结果:2mmol/L Al3+染毒组caspase-3基因的表达为0.98±0.120,而Nec-160μmol/L组和Nec-190μmol/L组caspase-3的表达分别为0.50±0.077和0.44±0.050,同对照组相比,两组caspase-3的表达均下降(P<0.01)。2mmol/LAl3+染毒组的LC3-Ⅱ基因的表达为1.82±0.047,而60μmol/L Nec-1组和90μmol/L Nec-1组的LC3-Ⅱ表达分别为1.00±0.022和0.97±0.035,同对照组相比,两组LC3-Ⅱ的表达均呈下降(P<0.01)。[结论]Nec-1可使铝作用下的神经细胞活力上升,并使神经细胞的自吞噬和凋亡基因表达下降。
- 徐丽张勤丽牛侨
- 关键词：铝细胞培养凋亡
- 程序性坏死阻断剂对铝致神经细胞凋亡的影响及其机制
- 2010年
- 目的 了解程序性坏死阻断剂necrostatin（Nee-1）对铝诱导的神经细胞凋亡的影响,并探讨Nec-1对Caspases凋亡通路的作用机制.方法 用4 mmol/L铝染毒神经母细胞瘤细胞株（SH-SYSY）制备铝致神经细胞死亡模型,在不同浓度铝和（或）Nec-1作用下检测细胞活力的变化,用Heochst 33342/碘丙啶（PI）双染法观察细胞的凋亡和坏死现象,Annexin V/PI双染法定量细胞的凋亡率和坏死率.用Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9酶活力的变化检测凋亡通路,用免疫细胞化学法检测核转录因子（NF-κB）和细胞色素c（Cyt-c）蛋白表达的变化.结果 随着铝染毒剂量的加大,细胞活力明显下降;但加入60 μmol/L Nec-1后,细胞活力明显增强.差异有统计学意义（P〈0.05）. Nec-1浓度的提高使细胞活力明显上升,表现了明显的促进神经细胞生长、抑制细胞死亡的作用.凋亡和坏死的荧光显微镜观察及流式细胞术定量检测结果 表明,随着铝染毒剂量的增加,神经细胞的凋亡率与坏死率明显上升,但在0～90μmol/L Nec-1作用下,Nec-1浓度越高,细胞的坏死率降低越明显,差异均有统计学意义（P〈0.05,P〈0.01）.同时,虽然Nec-1是程序性坏死的阻断剂,但其对凋亡率也有明显的影响,可以使染铝细胞的凋亡率明显下降,差异有统计学意义（P〈0.05,P〈0.01）.对Nec-1作用后细胞的凋亡相关酶Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9活力变化检测结果 表明,Nec-1对Caspase-9活力的影响不明显,且对线粒体通路的凋亡诱导分子Cry-c的作用也不明显;但对Caspase-8活力的影响明显,表现在可以明显降低各染铝细胞的Caspase-8活力,提高NF-κB蛋白表达量和在高剂量染铝细胞中降低Caspase-3的活力.结论 Nec-1可以降低铝诱导的神经细胞凋亡,并通过死亡受体通路Caspase-8上调NF-κB表达,降低细胞凋亡率.
- 张勤丽吉秀亮郭卫力张策刘承芸牛侨
- 关键词：铝脱噬作用CASPASE类
- 程序性坏死在铝致神经母细胞瘤细胞SH－SY5Y死亡中的作用被引量：4
- 2009年
- 目的探讨程序性坏死是否存在于铝诱导的神经母细胞瘤细胞SH—SY5Y的死亡途径中。方法培养SH—SY5Y细胞，并用4mmol／L AlCl3·6H2O染毒制作铝致神经细胞死亡模型，按加入Nec-1剂量不同分别设对照组（0μmol／L）和30、60、90μmol／L组，检测SH-SY5Y细胞的活力、线粒体膜电位、活性氧含量及细胞的凋亡率和坏死率等。结果研究表明，加入Nec-1可以显著改善染铝后的细胞坏死样形态学改变。流式细胞仪检测结果表明，加入不同剂量的Nec-1（30、60、90μmol／L）后其细胞活力分别为0．58±0．03、0．68±0．04、1．03±0．17，与对照组（0．28±0．05）相比，差异有统计学意义（t值分别为3．25、3．36、4．56，P值均〈0．05）。Annexin V—PI双染法测定结果显示，不同剂量Nec-1（30、60、90μmol／L）作用后坏死率分别为10．40％±0．64％、5．43％±0．68％、6．28％±0．35％，与对照组（16．46％±0．54％）相比，差异有统计学意义（t值分别为3．62、7．32、6．96，P值均〈0．05），可以明显降低SH-SY5Y细胞的坏死率，但其作用后SH—SY5Y细胞凋亡率分别为7．66％±0．53％、5．68％±0．41％、4．13％±0．41％，与对照组（8．68％±0．36％）相比，差异无统计学意义（F=6．33，P=0．11）。加入不同剂量Nec-1（30、60、90μmol／L）后，其线粒体膜电位分别为49．42±5．96、84．79±6．86、95．51±7．01，60、90μmol／L剂量组与对照组（67．54±6．36）相比，差异有统计学意义（t值分别为3．21、4．01，P值均〈0．05）。但加入不同剂量的Nec-1（30、60、90μmol／L）后其活性氧含量分别为52．79±2．36、54．68±1．91、59．23±2．96，对照组为54．07±3．32，各组间差异无统计学意义（F=5．26，P=0．19）。结论用程序性坏死的特异阻断剂Nec-1可以有效阻断铝致SH—SY5Y细胞的死亡通路，提示程序性坏死是导致铝神经毒�
- 牛侨张勤丽郑金平刘承芸王亮
- 关键词：细胞死亡铝程序性坏死神经母细胞瘤
- Nec-1对铝致神经细胞凋亡和自噬的作用被引量：1
- 2010年
- 目的观察和探讨在铝致神经细胞死亡中,坏死抑制剂1(Nec-1)对凋亡和自噬的作用。方法用体外原代培养小鼠神经细胞的方法,制造铝损伤神经细胞模型,然后用细胞活力检测、荧光定量PCR(qRT-PCR)、蛋白印迹(Western-Blot)以及流式细胞术等方法从多角度对Nec-1的作用进行研究。结果①流式结果显示,在Al3+(2mmol/L)作用于神经细胞后,随着Nec-1剂量的增加,细胞的凋亡率呈下降趋势,且差异有统计学意义(P<0.05);②qRT-PCR结果显示,以Al3+(2mmol/L)为对照,Nec-1(60和90μmol/L)可使神经细胞的凋亡和自噬相关基因的表达呈显著性下降(P<0.05);③Western-Blot结果显示,同Al3+(2mmol/L)组比,Nec-1(60和90μmol/L)组凋亡相关蛋白caspase-3的表达下降(P<0.01),Nec-1(30和60μmol/L)可使自噬相关蛋白LC3-Ⅱ表达下降(P<0.05)。结论在本试验条件下,Nec-1可减少铝导致的神经细胞凋亡和自噬,起到保护神经细胞的作用。
- 徐丽张勤丽牛侨
- 关键词：铝凋亡
- 几种细胞毒性评价方法在纳米氧化铝神经细胞毒性研究中的应用比较被引量：8
- 2010年
- 目的 以微米氧化铝、纳米碳做对照,通过不同的细胞活力检测方法 观察纳米氧化铝对神经细胞活力的影响.方法 体外原代培养小鼠神经细胞,将纳米氧化铝、微米氧化铝、纳米碳均按正常对照组、62.5 μmol/L、125.0 μmol/L、250.0μmoL/L、500.0 μmol/L、1.0 mmol/L、2.0 mmol/L共7个剂量组分别染毒神经细胞,用细胞计数试剂（CCK-8）、噻唑蓝（MTT）及乳酸脱氢酶试剂（LDH）等方法 检测细胞活力[570 nm波长处的吸光度值（A570值）]的变化.结果 （1）CCK-8法检测结果 显示,250.0 μmol/L～2.0 mmol/L纳米氧化铝染毒组细胞活力（A570值分别为0.878±0.009、0.823±0.016、0.647±0.008、0.594 ±0.013）小于微米氧化铝染毒组（A570值分别为0.960±0.008、0.951±0.036、0.833 ±0.008、0.708±0.012）和纳米碳染毒组（A570值分别为0.977±0.003、0.973±0.002、0.924±0.006、0.891±0.023）,差异具有统计学意义（同剂量组纳米氧化铝与微米氧化铝比较,t值分别为-0.082、-0.128、-0.186、-0.114,P值均〈0.01;与纳米碳比较,t值分别为-0.099、-0.150、-0.277、-0.297,P值均〈0.01）.（2）MTT法检测结果 显示,在500.0 μmol/L、1.0 mmol/L剂量下,纳米氧化铝染毒组细胞活力（A570值分别为0.648±0.095、0.575±0.061）小于微米氧化铝染毒组（A570值分别为0.830±0.044、0.816±0.014）和纳米碳染毒组（A570值分别为0.889±0.009、0.765±0.049）,差异具有统计学意义（同剂量组纳米氧化铝与微米氧化铝比较,t值分别为-0.183、-0.242,P值均〈0.01;与纳米碳比较,t值分别为-0.241、-0.190,P值均〈0.01）.（3）LDH法检测的结果 显示,纳米氧化铝染毒组在125.0 μmol/L～2.0 mmol/L剂量下的细胞LDH释放量（A570值分别为1.862±0.102、1.905±0.066、1.930±0.037、1.946±0.033、1.967±0.068）高于纳米碳染毒组（A570值分别为1.484±0.110、1.559 ±0.039、1.663±0.014、1.732±0.076、1.765 ±0.073）,差异具有统计学意义（t值分别�
- 徐丽张勤丽高福平聂继盛牛侨
- 关键词：氧化铝细胞增殖
- 慢性铝暴露对小鼠认知能力影响及与β-APP关系被引量：7
- 2011年
- 目的探讨慢性铝暴露对小鼠认知能力的影响及与脑组织β-淀粉样前体蛋白(β-APP)、β-淀粉样蛋白(β-AP)表达的关系。方法动物模型高、中、低剂量组每日用AlCl3含量120、12、1.2 mg/kg饲料进行喂养,对照组喂饲正常饲料,染毒9个月后用Morris水迷宫实验、跳台实验、避暗实验进行行为学测试,取脑,观察小鼠组织学变化,用蛋白质印迹(western-blot)法检测小鼠脑组织中β-APP和β-AP蛋白的表达。结果对照组小鼠跳台实验潜伏期与错误次数为(205.00±30.09)s和(0.29±0.49)次,铝暴露中、高剂量组跳台实验潜伏期与错误次数分别为(159.63±59.61)、(103.02±41.86)s和(1.63±1.06)、(2.00±1.63)次,与对照组比较,潜伏期明显缩短,错误次数明显增加(P<0.05);与对照组避暗实验潜伏期(265.57±15.05)s比较,铝暴露中、高剂量组小鼠避暗潜伏期〔(126.71±25.73)、(45.57±33.13)s〕明显缩短(P<0.05);与对照组比较,铝暴露中、高剂量组β-APP、β-AP蛋白表达量均明显增多(P<0.05,P<0.01)。结论慢性铝暴露可导致小鼠β-APP和β-AP的表达上调,这可能是铝致小鼠认知功能障碍的重要机制之一。
- 张玲潘宝龙吉俊伟张勤丽牛侨
- 关键词：学习记忆
- MAPK信号通路在铝致SH-SY5Y细胞死亡中的作用被引量：2
- 2014年
- 目的研究铝致人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)死亡过程中MAPK信号通路的作用,探索铝致神经细胞死亡的机制。方法用4 mmol/L的Al Cl3·6H2O染毒SH-SY5Y细胞模拟铝致神经细胞死亡模型,用凋亡的特异性阻断剂z VAD-fmk(20μmol/L)抑制凋亡发生,用程序性坏死的特异性阻断剂necrostatin-1(Nec-1,60μmol/L)抑制程序性坏死发生,用CCK-8检测不同组间细胞活力的变化,用流式细胞术检测凋亡率及坏死率的差异,用蛋白印迹法检测MAPK信号通路蛋白磷酸化水平的改变。结果与空白对照组、溶剂对照组、z VAD-fmk对照组和Nec-1对照组相比,染铝组、凋亡抑制组和程序性坏死抑制组的细胞活力下降(P<0.05);与染铝组相比,程序性坏死抑制组和凋亡抑制组的细胞活力上升(P<0.05)。与空白对照组、溶剂对照组、z VAD-fmk对照组和Nec-1对照组相比,染铝组、凋亡抑制组和程序性坏死抑制组的凋亡率和坏死率上升(P<0.05);与染铝组相比,凋亡抑制组和程序性坏死抑制组的凋亡率和坏死率下降(P<0.05)。与空白对照组、溶剂对照组、z VAD-fmk对照组和Nec-1对照组相比,染铝组、凋亡抑制组和程序性坏死抑制组p38磷酸化水平升高,ERK磷酸化水平下降(P<0.05);与染铝组相比,程序性坏死抑制组的p38磷酸化水平下降,ERK磷酸化水平上升(P<0.05)。结论 MAPK信号通路中的p38和ERK信号通路参与了铝致SH-SY5Y细胞程序性坏死,ERK信号通路参与了铝致SH-SY5Y细胞凋亡,而JNK信号通路未参与铝致SH-SYSY细胞死亡。
- 贾晓芳张勤丽牛侨
- 关键词：铝MAPK信号通路凋亡程序性坏死
