国家科技重大专项(2008ZX08008-002)
- 作品数：10 被引量：36H指数：3
- 相关作者：陈玉林白丁平方堃屈雷刘东军更多>>
- 相关机构：西北农林科技大学榆林学院内蒙古大学更多>>
- 发文基金：国家科技重大专项国家绒毛用羊产业技术体系建设专项国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 太行黑山羊FGF5基因CDs区的序列特征及其表达规律研究被引量：2
- 2010年
- 【目的】克隆太行黑山羊成纤维细胞生长因子5(FGF5)基因CDs区,并对其进行序列特征分析和实时荧光定量表达检测。【方法】于2009年的7～10月份采集太行黑山羊的皮肤组织样品,利用RT-PCR方法克隆FGF5基因CDs区序列,并分析其序列特征及在不同生长发育时期的表达情况。【结果】太行黑山羊FGF5基因CDs区全序列长度为813bp,编码270个氨基酸,其中包含一个FGF结构域(87～221位氨基酸);太行黑山羊FGF5基因CDs区核苷酸序列与牛、马、人、猩猩和小鼠的同源性分别为98%,92%,90%,90%和86%,其编码氨基酸序列与牛、马、人、猩猩和小鼠的同源性分别为98%,91%,91%,91%和91%;实时荧光定量分析结果表明,在检测的4个月份的皮肤组织中,FGF5基因在9月份表达量显著高于7、8、10月份(P<0.05),而7、8、10月份之间表达量无显著差异(P>0.05)。【结论】太行黑山羊的FGF5基因编码的氨基酸高度保守;太行黑山羊毛囊发育在7、8月份处于生长期,9月份由生长期向退行期过渡,10月份进入退行期。
- 何永新陈玉林姜维薛鹏
- 关键词：RT-PCR基因序列氨基酸序列
- 转K2.9基因绒山羊体细胞核移植技术体系的优化研究被引量：1
- 2012年
- 【目的】利用体细胞核移植技术制备转毛角蛋白Ⅱ型中间丝K2.9基因的高绒质绒山羊胚胎,为绒山羊优良品种的培育提供一种全新的技术材料。【方法】以含有Neor基因标记的K2.9毛囊特异表达载体pcDNA3.1-K转染绒山羊胎儿成纤维细胞,经G418筛选获得转K2.9基因细胞,将获得的转基因阳性细胞与体外成熟的绒山羊卵母细胞进行核移植,并对生产的重构胚进行了体外培养。本文分别进行了激活方法、供体细胞和卵母细胞来源的筛选,且对获得的囊胚进行了PCR鉴定。【结果】(1)Iono+6-D对成年羊卵母细胞的孤雌激活效果好于A23187+6-D,显著提高了胚胎的卵裂率。(2)羔羊孤雌胚的卵裂率显著低于成年羊,但囊胚率差异不显著。(3)来自2只绒山羊胎儿的转基因成纤维细胞对核移植胚的发育没有显著影响,但2号羊的转基因细胞显著提高了融合率。(4)以羔羊卵进行核移植,显著降低了核移植胚的发育率。(5)对获得的囊胚进行PCR鉴定,成功扩增到目的基因。【结论】将K2.9毛囊特异表达载体pcDNA3.1-K转染的绒山羊胎儿成纤维细胞作为供体细胞,核移植到成年羊卵母细胞中,以Iono+6-D进行激活,首次成功、高效地获得携带K2.9基因的绒山羊囊胚。
- 潘晓燕于永生刘晓辉王正朝王晓阳朴庆林张立春金海国
- 关键词：绒山羊胎儿成纤维细胞转基因体细胞核移植
- 陕北白绒山羊Lhx2毛囊表达载体构建及转染成纤维细胞的研究
- 2013年
- 以陕北白绒山羊毛囊生长期皮肤组织cDNA为模板,扩增出Lhx2基因的CDS区,成功构建了以KAP6.1为启动子表达Lhx2基因的绿色荧光表达载体pIRES2-KAP-LHX-EGFP.并利用脂质体介导转染绒山羊胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得了稳定转染的细胞系,经PCR检测显示外源基因已整合到细胞基因中.研究结果为进一步开展Lhx2基因对绒山羊毛囊发育的影响和转Lhx2基因绒山羊的生产提供了前期研究基础.
- 白丁平陈静谢璐娜刘敏陈玉林
- 关键词：绒山羊胎儿成纤维细胞
- 陕北白绒山羊种公羊的体细胞克隆被引量：12
- 2012年
- 【目的】利用体细胞核移植技术克隆陕北白绒山羊优秀种公羊个体。【方法】以特别优秀成年陕北白绒山羊种公羊耳部皮肤成纤维细胞为供体细胞,体外培养成熟的陕北白绒山羊卵母细胞作为受体,利用显微操作方法对成熟卵母细胞进行去核操作,然后将供体细胞注射到其卵周隙内,经电融合将其导入去核卵母细胞内形成核移植重组胚。利用钙离子载体Ionomycine联合蛋白酶抑制剂6-甲基氨基嘌呤(6-DMAP)对核移植重组胚进行激活处理,挑选激活后完整的胚胎继续进行体外培养,然后在2～16细胞期时将克隆胚胎移植到相应的同期发情受体母羊体内,利用PCR-RFLP技术鉴定克隆羊。【结果】构建了体细胞核移植胚胎253枚,重组胚胎的融合率为71.54%(181/253),体外培养后的卵裂率为68.33%(123/180),囊胚发育率为25.20%(31/123);在此基础上,构建了537枚克隆胚,将其中卵裂的359枚分别移植到32只代孕母羊体内,移植60d后,有2只受体母羊确认妊娠,最终1只受体母羊妊娠第4月流产出2只死羔;另1只受体母羊维持到期并顺产体细胞克隆羊1只。经遗传学鉴定,2只流产羊羔与1只存活个体均为体细胞核移植后代。【结论】获得陕北白绒山羊克隆个体,建立了相对完善的陕北白绒山羊克隆技术体系。
- 屈雷雷安民闫海龙于鸿浩袁超王磊白丁平陈生会冯平马晓玲高晔陈玉林
- 关键词：体细胞克隆核移植陕北白绒山羊
- 小鼠KGF基因毛囊特异性表达载体的构建及mESC脂质体悬浮转染条件的优化被引量：1
- 2011年
- 旨在构建小鼠角质细胞生长因子(KGF)真核表达载体pCDsR-UKA,通过脂质体转染法转染小鼠胚胎干细胞(mESC),并进一步优化其转染条件,最终获得可以正常生长并稳定表达红色荧光蛋白的转KGF基因的ES细胞。利用RT-PCR技术扩增小鼠KGF基因cDNA并构建表达载体pCDsR-UKA(6.6 kb),经鉴定正确的重组质粒DNA用脂质体包裹后转染mESC。从小鼠成纤维细胞cDNA扩增出891 bp的KGF基因片段与UHS启动子和BGH polyA序列成功重组到pCDsRed2载体中。经酶切和DNA测序验证,插入载体的DNA片段为KGF基因且方向正确。采用脂质体法优化转染条件,mESC最高转染效率达到(34.4±4.1)%。经G418筛选的转基因ES细胞通过PCR鉴定证实外源基因已整合在ES细胞基因组中。成功获得了小鼠KGF基因片段,以及真核表达载体pCDsR-UKA,经优化的脂质体悬浮法转染条件,在六孔板中当DNA与脂质体比例为3∶10时,可获得最佳转染效率且不改变ES细胞的生长状态,经筛选获得了转基因ES细胞克隆。为下一步通过四倍体补偿技术获得ES小鼠提供了转基因ES细胞。
- 梁伟肖红高笑宇杜晓媛汪慧郭旭东刘东军
- 关键词：KGF胚胎干细胞毛囊红色荧光蛋白脂质体转染悬浮法
- piggyBac转座子在绒山羊基因组中的整合位点及其特征分析被引量：4
- 2012年
- 【目的】构建piggyBac(PB)转座子表达载体系统,研究PB转座子在绒山羊基因组中的整合位点。【方法】构建pB-CMV-EGFP-Neo转座载体和pcDNA-Trans辅助载体,利用lipofectamine 2000介导共转染绒山羊胎儿成纤维细胞,经G418筛选获得稳定转染的转基因细胞系。提取转基因细胞基因组DNA,利用反向PCR检测piggyBac转座子整合位点。【结果】构建了转座系统并成功介导外源基因在绒山羊成纤维细胞染色体中整合,获得了转基因细胞系;反向PCR检测显示在绒山羊基因组中有21个PB转座子整合位点;整合位点TTAA毗邻一侧的5个碱基组成中,PB转座子3′倾向于插入到富含AT(58.35%)碱基的区域,PB转座子5′倾向于插入到富含GC(57.8%)。【结论】PB转座子可在绒山羊基因组中发生高效转座,获得的整合位点信息可为利用PB转座子开展绒山羊研究提供理论参考。
- 白丁平方堃杨明明屈雷陈玉林
- 关键词：PIGGYBAC绒山羊基因组整合位点
- 陕北白绒山羊Lhx2基因cDNA序列的克隆与原核表达被引量：1
- 2012年
- 根据GenBank中已发表的Lhx2基因序列设计引物,采用RT-PCR方法,从陕北白绒山羊皮肤组织克隆Lhx2基因编码区cDNA,对其进行生物信息学分析,并构建原核表达载体pET-Lhx2,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。最终获得陕北白绒山羊Lhx2基因,长1 221bp;酶切和测序结果显示,原核表达载体pET-Lhx2构建成功;SDS-PAGE和Western blot分析表明,重组原核表达载体在大肠杆菌中成功表达出目的融合蛋白。
- 刘敏白丁平耿荣庆方堃陈玉林
- 关键词：陕北白绒山羊克隆原核表达
- 大肠杆菌cysE和cysM基因的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备被引量：2
- 2011年
- 【目的】克隆大肠杆菌半胱氨酸合成酶(包括丝氨酸乙酰转移酶(cysE)和O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶(cysM))的基因,对其进行原核表达,并制备相应蛋白的抗体。【方法】用PCR方法从大肠杆菌BL21(DE3)中扩增cysE和cysM基因,构建其原核表达载体pET32a(+)-cysE和pET32a(+)-cysM,对其进行BamHⅠ和SacⅠ双酶切鉴定和测序验证后转入大肠杆菌中进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot(以His抗体作为一抗)检测。用纯化的cysE和cysM蛋白作为抗原免疫新西兰大耳白兔,制备多克隆抗体,并通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗体效价。【结果】PCR获得了822bp的cysE基因和912bp的cysM基因。原核表达质粒pET32a(+)-cysE和pET32a(+)-cysM构建成功,并可在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,表达的cysE和cysM重组蛋白分子质量分别为56和58ku。制备的多克隆抗体具有较强的免疫结合活性,抗体滴度均达到1∶102 400。【结论】成功克隆了大肠杆菌cysE和cysM基因,并实现了原核表达,同时制备出了相应的多克隆抗体。
- 方堃白丁平陈玉林
- 关键词：大肠杆菌
