江苏省“135”工程重点医学人才基金(38RC2002038)
- 作品数：13 被引量：36H指数：4
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- 相关机构：苏州大学河北医科大学第一医院苏州市中医医院更多>>
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- 骺板软骨细胞的体外培养及鉴定被引量：4
- 2007年
- 目的:建立体外培养及鉴定骺板软骨细胞的方法。方法:实验于2005-03/2006-05在苏州大学附属儿童医院骨科实验室完成。选用3只生后14～28d的新西兰幼兔,空气栓塞处死,暴露股骨下端和胫骨上端,分别取2处的骺板组织,将其剪切成1～3mm3的小块,经胰蛋白酶消化,接种于含150g/L牛血清的1640培养基中,饱和湿度培养,传代。①细胞接种后3h在倒置显微镜下观察细胞生长情况,见细胞贴壁后每天观察2次。②第2代细胞达到80%～90%左右汇合时采用常规苏木精-伊红染色,光镜观察细胞爬片情况。③第3代细胞爬片至细胞达到80～90%左右汇合时,采用苏木素染色3min,3%亮绿染色5min,蕃红花“O”染色5min,光镜观察细胞产生蛋白聚糖情况。④采用PCR检测细胞Ⅱ型胶原的表达。⑤采用四唑盐MTT比色法检测细胞活性。结果:①骺软骨细胞刚接种后呈大小不等之圆形悬浮于培养液中,3h后见大部分细胞贴壁,24h后贴壁细胞呈短梭形、圆形、三角形和不规则形,见细胞分裂相。48h后见细胞伸展明显,细胞分裂相每高倍镜视野可见多个。经隔日换液细胞生长至第5天,细胞呈聚集生长,达到汇合状态,将细胞传代。接种后第1代细胞2d后呈梭形,培养4d传至第2代,第2代细胞长满瓶底后,90%呈胞膜较厚的圆形,10%为梭形,第3代、第4代亦如此。传至第5代见肥大细胞增多,细胞松散,折光性减弱,呈凋亡状态。②细胞爬片后观察骺软骨细胞形态以梭形居多,同时也有圆形、三角形和不规则形。可见细胞分裂及细胞中的分泌小泡。③见细胞呈红色,无绿色,证明蕃红花“O”-亮绿染色阳性,显示所培养的细胞可以分泌蛋白聚糖。④PCR检测术所养细胞含有Ⅱ型胶原,电泳带在440bp上。⑤四唑盐MTT比色法检测显示,第3代骺软骨细胞的生长曲线近似倒“S”形,在第4,5,6天细胞呈对数生长,约在7,8,9,10d达平台期,至第12天细胞出现�
- 尹航张锡庆王晓东张亚王科文
- 关键词：骨骺软骨细胞细胞培养
- 大鼠脂肪组织来源的干细胞向成骨方向诱导分化的初步研究被引量：2
- 2006年
- 目的探索大鼠脂肪组织来源的干细胞的分离、培养的方法,以及在特定条件下向成骨细胞分化,探讨其作为骨组织工程种子细胞的可行性。方法取4周龄SD大鼠附睾处脂肪,成骨诱导培养基培养,组织化学、免疫细胞化学染色以及组织学定量检测其分化情况。结果从成体大鼠脂肪组织中培养出脂肪组织来源的干细胞,能稳定增殖传代,CD44、波形蛋白免疫组化染色阳性,证明其中胚层来源。在地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠的诱导下,脂肪组织来源干细胞的碱性磷酸酶活性增高,出现钙结节,四环素荧光染色阳性证实有新骨形成。碱性磷酸酶定量和钙定量随诱导时间延长表达增加。结论从脂肪组织中可获得具有多向分化潜能的干细胞,并能在体外稳定增殖传代,经诱导后可分化为成骨细胞,有可能成为骨组织工程较理想的种子细胞之一。
- 冯林张锡庆王晓东张亚尹航张婷王科文朱振洪
- 关键词：干细胞成骨细胞
- 兔骨髓间充质干细胞复合两种材料体外生物相容性的比较被引量：6
- 2006年
- [目的]探讨丝素蛋白和纳米晶羟基磷灰石胶原/骨体外生物相容性,为组织工程寻找理想的载体材料。[方法]体外培养兔骨髓间充质干细胞分别于丝素蛋白和纳米晶羟基磷灰石胶原/骨体外复合培养,应用扫描电镜、激光共聚焦显微镜,四唑盐比色试验(MTT法),观察材料上复合培养的细胞的生物学特性。[结果]兔骨髓间充质干细胞可以在丝素蛋白和纳米晶羟基磷灰石胶原/骨良好的黏附、增殖和生长。两种材料相比较其相容性没有明显的差异。[结论]丝素蛋白和纳米晶羟基磷灰石胶原/骨均具有良好的生物相容性,可以作为组织工程理想的载体材料。
- 尹航王晓东张亚张希峰刘新晖张锡庆董寅生
- 关键词：细胞载体丝素蛋白生物相容性
- 人骨髓间充质干细胞向成骨细胞和成软骨细胞分化的能力(英文)被引量：1
- 2004年
- 背景:利用骨髓间质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)的多向分化性,选择合适的生物材料和适当的生长因子联合应用,可达到修复组织缺损的目的,MSCs细胞具有取材方便,对身体健康损害小,来源于自体干细胞诱导构建的组织不存在MHC限制等优点,所以日益受到人们的重视。目的:探讨人骨髓间充质干细胞向成骨和成软骨细胞诱导分化的能力。设计:单一样本研究。单位:苏州大学附属儿童医院骨科,苏州大学生命科学院生物技术研究所。材料:RPMI1640完全培养基,地塞米松,β-甘油磷酸钠,抗坏血酸,鼠抗人一抗,羊抗鼠二抗,链球菌亲和素(三抗),DAB(1:50),100mL/L胎牛血清,维生素C,转化生长因子-β1(TGF-β1)等。方法:选用不同代次的MSCs细胞,分别使用成骨和成软骨条件培养基培养,观察细胞的形态学变化,同时采用细胞化学和免疫组化的方法检测碱性磷酸酶,钙盐沉积,糖胺多糖分泌和I,Ⅱ胶原的表达。主要观察指标:骨髓基质干细胞向成骨细胞分化;骨髓基质干细胞向成软骨细胞分化。结果:MSCs细胞在地塞米松、维生素C和β-甘油磷酸钠的作用下,15d后可见细胞变为多边形,ALP和I型胶原染色阳性,形成钙结节,表现成骨细胞分化特点;而在维生素C和TGF-β1的作用下,7d可见细胞多为圆形,糖胺多糖和II型胶原染色阳性,表现成软骨细胞分化特点。
- 王明海王晓东吴明媛张锡庆张德强张亚王科文尹航冯林刘柏龄
- 关键词：干细胞骨髓成骨细胞
- 三种不同载体材料体外生物相容性的比较被引量：2
- 2005年
- 目的 探讨纳米晶羟基磷灰石胶原复合材料(NHAC)、非纳米晶羟基磷灰石胶原复合材料(HAC)和珊瑚羟基磷灰石(CHA)的体外生物相容性,为组织工程提供理想的细胞基质载体材料。方法 将人骨髓基质干细胞分别与上述三种载体材料体外复合培养,应用倒置显微镜、扫描电镜、四唑盐比色试验(MTT法)及碱性磷酸酶(ALP)活性测定,对材料上复合培养的细胞进行形态学和功能测定。结果 骨髓基质干细胞能在NHAC和CHA两种材料上良好地黏附、增殖和生长。细胞的活性和碱性磷酸酶活性未受到材料的影响;而 HAC不利于人骨髓基质干细胞的黏附、增殖,并使碱性磷酸酶活性降低。结论 NHAC和CHA两种材料具有良好的生物相容性,可作为骨组织工程理想的骨替代材料;HAC不适合做细胞外基质。
- 王晓东刘新晖张亚张德强王明海张希峰王科文张锡庆
- 关键词：体外生物相容性HAC人骨髓基质干细胞胶原活性测定
- 体外直接共培养兔肾血管内皮细胞和成骨细胞
- 2007年
- 目的观察兔肾血管内皮细胞(renal vascular endothelia cells,RVECs)和兔骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,RMSCs)诱导的成骨细胞(osteoblasts,OB)直接共培养是否具有良好的细胞相容性,探索二者共培养的合适比例。方法抽取兔骨髓,离心法获取RMSCs,经条件培养基获得OB并鉴定;取兔双肾行三步梯度筛网法获得RVECs并鉴定。二种细胞按OB与RVECs 3:1、2:1及1:1比例直接共培养及各自单独培养,倒置显微镜及Masson染色观察生长情况,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色观察细胞增殖分化能力。结果共培养细胞增殖快于单一细胞,OB与RVECs 2:1比例培养优于3:1和1:1,增殖最快。从OB的ALP染色阳性率看,和RVECs共培养的OB染色阳性率比单纯OB高,OB与RVECs 2:1比例培养的阳性率最高,表明RVECs能显著增强OB的ALP活性。结论RVECs和RMSCs诱导的OB体外直接共培养具有良好的细胞相容性,可促进OB的增殖分化,促进其ALP的分泌,提高OB的成骨能力。二者按OB与RVECs 2:1混合培养是较佳比例。
- 张亚王晓东王明海冯林尹航张锡庆
- 关键词：内皮细胞成骨细胞
- 兔骨髓间充质干细胞在丝素蛋白上的体外培养被引量：7
- 2006年
- 目的观察兔骨髓间充质干细胞复合多孔丝素蛋白体外培养情况，探讨多孔丝素蛋白适合细胞生长的孔径及作为支架材料的意义。方法取4周龄雄性新西兰大耳白兔4只．经戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，抽取骨髓5ml／只。与3ml肝素（625U/ml）混匀。抗凝骨髓5ml加入等量Hanks液混匀，以1份淋巴细胞分离液上面加2份稀释骨髓的比例离心，取有核细胞层，Hanks液洗2次，以3×10^6／ml细胞密度接种于50ml培养瓶，37℃，5％CO2，饱和湿度培养，48h首次换液，以后2～3d换液1次，均为全量换液。当原代细胞培养15～20d，细胞占瓶的90％以上，消化、传代为1代，以后5～7d传代1次。将传至3代的细胞接种于平均孔径为58μm、78μm、111μm的丝素材料上，共培养8d。倒置显微镜连续观察．并于第1d、第4d、第8d取三种材料行扫描电镜、激光共聚焦显微镜观察生长情况。结果倒置显微镜观察，材料上细胞看不清。可见板底的细胞一天比一天多。扫描电镜上细胞材料均清晰，第1d、第4d、第8d的标本显示细胞越来越多，并可见颗粒状、丝状基质物质。激光共聚焦显微镜是动态观察细胞．将细胞标记好后，复合在材料上，养在培养液中观察细胞的荧光强度，随着培养时间的增加荧光区越来越大。三种显微镜观察均显示细咆生长繁殖良好，形态、活性正常，111μm孔径的材料尤为突出。结论多孔丝素蛋白具有很好的生物相容性、细胞吸附性和体内降解性，作为骨组织工程的支架材料具有一定的应用价值，但要选择其合适的孔径。
- 张亚王晓东张希峰王明海张锡庆
- 关键词：骨髓干细胞
- 骨组织工程再血管化种子细胞来源:兔肾微血管内皮细胞体外培养及其细胞表型的研究(英文)被引量：2
- 2004年
- 背景:在骨组织工程研究中,面临从体外实验过渡到体内成骨时如何快速血管化的问题,尽早建立血运才能保留组织工程骨的成骨优势。在体外短时间内能大量扩增且纯度较高的细胞,才能成为组织工程化骨再血管化理想的种子细胞。目的:探索肾微血管内皮细胞的体外培养方法,并对其进行鉴定和表型研究,拟为骨组织工程再血管化提供理想的种子细胞。设计:单一样本研究。单位:苏州大学附属儿童医院骨科,苏州大学生命科学院生物技术研究所。材料:实验于2003-05/2004-04在苏州大学附属儿童医院骨科实验室完成。实验材料为CO2培养箱,M199,胎牛血清,Ⅳ型胶原酶,40g/L多聚甲醛,20g/L戊二醛,ECGF,鼠抗人第八因子单克隆抗体(抗FⅧ-RAg),多标记免疫分析系统(1420,WALLACBLCTOR2),离心机,倒置显微镜,免疫荧光显微镜等。方法:采用三步梯度筛网法,先获得较高纯度的肾血管球,再应用肾血管球外植法体外培养肾微血管内皮细胞。进一步对肾微血管内皮细胞进行免疫组化法的Ⅷ因子相关抗原鉴定,用透射电镜观察细胞浆Weibel-Palade小体,以及采用间接免疫荧光法检测CD31,CD34及CD44表达。主要观察指标:肾微血管内皮细胞形态、活性及表型。结果:体外培养出纯度很高的血管内皮细胞并培养了11代。此外,免疫组化显示Ⅷ因子相关抗原阳性,电镜下?
- 王明海吴明媛张锡庆王晓东张亚王科文尹航冯林刘柏龄
- 关键词：细胞细胞表型
- 兔血管内皮细胞和诱导成骨细胞在可注射纳米材料上的共培养被引量：2
- 2007年
- 目的:将可注射纳米骨材料与共培养的兔肾血管内皮细胞和兔骨髓间充质干细胞诱导的成骨细胞复合,并构建可注射细胞型纳米组织工程骨,观察它们体外培养的相容性。方法:实验于2003-09/2004-11在苏州大学附属儿童医院完成。①实验材料:取16周龄雄性新西兰大耳白兔,体质量1.5kg左右。②实验方法:麻醉后抽取兔骨髓,用淋巴细胞分离液分离出其中的间充质干细胞,在含体积分数为0.15牛血清的RPMI1640液中培养。骨髓间充质干细胞在条件培养基中,7d后可见细胞变为多边形,碱性磷酸酶和Ⅰ型胶原染色阳性,形成钙结节,表现成骨细胞分化特点。采用三步梯度筛网法,获得肾血管球,5g/L胶原酶Ⅳ37℃消化15～20min,离心沉淀获取血管内皮细胞,在含体积分数为0.15小牛血清的M199中培养。③实验评估:免疫组织化学法进行第Ⅷ因子相关抗原鉴定,透射电镜观察细胞浆Weibel-Palade小体,间接免疫荧光法检测CD31、CD34及CD44的表达。将共培养的兔肾血管内皮细胞、成骨细胞与可注射纳米骨材料体外复合培养,进行形态学观察和功能测定。结果:①在一定培养条件下成功诱导兔骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。②培养的血管内皮细胞免疫组织化学法检测第Ⅷ因子相关抗原阳性,透射电镜观察到细胞浆中的Weibel-Palade小体,间接免疫荧光法检测CD31、CD34表达阳性,CD44阴性。③共培养的兔肾血管内皮细胞、成骨细胞在可注射纳米骨材料上生长、增殖良好,细胞活性和碱性磷酸酶活性未受到影响。结论:可注射纳米骨材料具有良好的细胞相容性,可作为骨组织工程理想的可注射载体材料。
- 张亚王晓东王明海冯林尹航张锡庆
- 关键词：内皮细胞成骨细胞
- 可注射性纳米组织工程骨应用于牵拉成骨的实验研究被引量：2
- 2006年
- 目的将可注射性纳米组织工程骨注入骨延长区,观察其能否加速延长区的骨生成。方法用新西兰大耳白兔制作兔牵拉成骨模型,获得成功存活动物71只,分为4组,A:对照组,17只;B:注射共培养成骨细胞、内皮细胞组,18只;C:注射单纯胶体纳米材料组,18只;D:注射共培养成骨细胞、内皮细胞复合胶体纳米材料组,18只。术后5d行胫骨延长,速度1mm/d,共延长20d,延长完成后,A组不做其他治疗;B组将共培养成骨细胞、内皮细胞悬液2ml注入骨延长区,细胞总数量约1×107个;C组将单纯纳米材料2ml注入骨延长区;D组将可注射纳米组织工程骨2ml注入骨延长区,通过X线检测、骨密度(BMD)测定观察延长结束后第3、6、9周骨愈合情况。结果BMD和X线检测结果显示注射纳米组织工程骨组新生骨质量较高,骨愈合情况要优于其他组。结论可注射性纳米组织工程骨应用于牵拉成骨,可促进延长区骨生成,且优于单纯注射细胞或可注射性纳米载体材料。
- 张锡庆王明海冯庆玲王晓东张亚尹航
- 关键词：干细胞骨生成
