国家重点基础研究发展计划(2011CB710800)
- 作品数：101 被引量：276H指数：7
- 相关作者：杨立荣吴坚平徐刚倪晔郑裕国更多>>
- 相关机构：浙江大学江南大学浙江工业大学更多>>
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- 相关领域：生物学化学工程理学轻工技术与工程更多>>
- 采用复合保护剂提高重组普鲁兰酶稳定性被引量：4
- 2015年
- 通过向重组普鲁兰酶(PUL)酶液中添加保护剂和防腐剂以提高其热稳定性及储存稳定性,在不同温度下研究了复合保护剂对酶液的热稳定性影响,并研究了保护剂和防腐剂在常温保藏下对酶液贮存稳定性的影响。结果表明,明胶、甘油、Tween20和Ca2+四种保护剂能显著提高PUL的热稳定性,并通过正交试验得到了效果最佳的复合保护剂配方,即Tween20 2 m L/L,明胶6 g/L,甘油5%,Ca2+0.1 mol/L。在60℃下,添加复合保护剂的PUL酶液保温1 h后的酶活保留率为96.07%,较对照高出85.29%;在55℃,通过添加复合保护剂,半衰期较对照提高了3.27倍。最终在常温保藏90 d后,含有复合保护剂和防腐剂(1 g/L山梨酸钾和1 g/L苯甲酸钠)的PUL酶活保留率高达85.25%,达到了工业保藏的需求。
- 赵伟超聂尧穆晓清张荣珍徐岩
- 关键词：普鲁兰酶保护剂热稳定性
- 基于化学修饰法探讨脂肪酶对手性伯醇的识别机理被引量：1
- 2013年
- 洋葱假单胞菌脂肪酶(PcL)催化多种手性伯醇酯的不对称水解反应显示其对结构中含有额外的非酯键氧原子的手性伯醇酯的对映体选择性较高,而对不含额外氧原子的选择性差。分别用多种氨基酸残基特异性的修饰剂修饰PcL,结果发现经N-乙酰咪唑(NAI)修饰酪氨酸残基(Tyr)后PcL对含额外非酯键氧原子的手性伯醇酯对映体选择性显著降低,而对不含额外氧的伯醇酯选择性几乎不受影响。蛋白质谱证实产生主要影响的是位于PcL活性口袋内的Tyr29残基,手性伯醇酯能否与Tyr29形成额外氢键决定了PcL对其选择性。分子动力学模拟表明,Tyr29被修饰的PcL不能与底物形成氢键,因此选择性明显下降。这一发现成功揭示了脂肪酶对手性伯醇对映体选择性的分子识别机理。
- 周勤丽孟枭徐刚杨立荣
- 关键词：化学修饰对映体选择性分子动力学模拟
- 分子模拟指导化学修饰对有机相中脂肪酶的性能强化被引量：1
- 2015年
- 脂肪酶是一种应用广泛的重要生物催化剂,它对手性底物具有良好的立体选择性,而且能适应包括疏水有机溶剂在内的多种非天然反应介质。提高脂肪酶在非天然环境中的立体选择性已经成为关于脂肪酶的研究热点。然而已有研究在提高选择性的同时,往往伴随催化活力的降低。本文提出一种基于计算机模拟的理性改造方法,能够在不降低脂肪酶活力的情况下大幅提高其在有机介质中的立体选择性。以洋葱假单胞菌脂肪酶(Pseudomonas cepacia lipase,Pc L)在正己烷中催化手性仲醇的转酯化反应为模型,借助分子动力学模拟,预测N-乙酰咪唑(NAI)修饰Pc L的效果。蛋白质谱证实产生主要影响的是位于Pc L活性口袋内的Tyr29残基。进一步通过实验验证,发现经NAI修饰酪氨酸残基(Tyr)后Pc L催化拆分手性仲醇的对映体选择性最高从E=12.6提高到48.1,同时催化活力也有所提高。
- 郭丽徐刚吴坚平杨立荣
- 关键词：化学修饰对映体选择性脂肪酶
- 微粒添加对棘白菌素B发酵过程的影响被引量：1
- 2015年
- 阿尼芬净是一种新型的抗真菌药物,能够抑制各种致病念珠菌在活体内外的活性。棘白菌素B(Echinocandin B,ECB)是合成阿尼芬净的关键前体,其发酵单位的高低直接关系到阿尼芬净的价格及市场前景。文中考察了构巢曲霉在摇瓶发酵生产ECB的过程中,添加滑石粉、Al2O3、玻璃珠等微粒对其发酵单位的影响。发现微粒的粒径和添加浓度是菌体形态和ECB产量的关键影响因素,添加20 g/L滑石粉(d50=14.2μm)和7颗玻璃珠(d=6 mm)可使ECB发酵产量分别比对照提高33.2%和41.7%,达到1 262.9 mg/L和1 344.1mg/L。结果表明微粒的添加可以显著地改善丝状微生物发酵过程中的菌丝形态,提高其产物的发酵产量,为丝状微生物发酵过程的优化提供了一种重要手段。
- 牛坤胡逸博毛健邹树平郑裕国
- 关键词：构巢曲霉微粒发酵
- 酰基供体对动态动力学拆分1-四氢萘胺的影响被引量：1
- 2014年
- 采用新型消旋催化剂耦合Novozym 435成功构建1-四氢萘胺的动态动力学拆分体系用于制备光学纯(R)-1-四氢萘胺。该反应存在着自催化酰胺化反应,会降低反应的对映体选择性。从改变酰基供体结构的角度出发来抑制这种自催化酰胺化反应,考察了不同酸部以及不同醇部的酰基供体对1-四氢萘胺动态动力学拆分反应的影响,发现随着酰基供体结构变得复杂,1-四氢萘胺动态动力学拆分反应结果也相应变得越好,当采用戊酸对氯苯酯作为酰基供体时,动态动力学拆分反应结果就可达到最佳,即转化率>99%,光学纯度eeP>99%。
- 戴晓庭孟枭徐刚吴坚平杨立荣
- 关键词：动态动力学拆分
- 定点突变提高醇脱氢酶LkTADH催化制备他汀关键手性砌块的酶活
- 2018年
- （S）-6-氯-3-羰基-5-羟基己酸叔丁酯[（S）-CHOH]是他汀类药物合成的关键手性中间体。利用醇脱氢酶催化6-氯-3,5-二羰基己酸叔丁酯不对称合成（S）-CHOH是很有潜力的制备路线,目前存在的主要问题是醇脱氢酶催化活性较低。首先对来源于Lactobacillus kefir DSM 20587的醇脱氢酶的四点突变体LkTADH（A94T/F147L/A202L/L199H）进行回复突变,确定了关键位点147和202,并获得比酶活提高1倍的突变体MF147L-A202L。对这两个位点进行饱和突变,获得比酶活比LkTADH提高1.47倍的突变体MF147I-A202L。其比酶活为10.17U/mg,为目前文献报道最高水平。通过动力学分析和分子对接,分析了突变位点对酶活影响的机制,为后续研究奠定了良好的基础。
- 陈方徐刚杨立荣吴坚平
- 关键词：醇脱氢酶分子改造
- 产D-海因酶微生物的筛选及其催化特性
- 2016年
- 为获得高活性和立体选择性海因酶生产菌株,首先采用氨基酸关环法合成了数种5'-单取代海因衍生物及N-氨甲酰-氨基酸,建立了相关液相色谱检测方法。然后以实验室保藏的野生菌株出发,利用底物诱导的方法筛选到6株具有D-海因酶活性的野生菌,其中荧光假单胞菌产生的D-海因酶具有较好的底物谱,较高的活性和立体选择性。经优化后,其最适产酶温度为30℃,培养时间为12 h,发酵活力达到92.1 U/L。该菌催化D-海因水解的最适反应温度为60℃,pH 8.5。在50 m L体系中,利用0.25 g菌体(干重)可对映选择性水解20 mmol/L对羟基苯海因底物,反应3 h转化率达到98%。
- 李磊许国超韩瑞枝倪晔
- 关键词：D-海因酶D-氨基酸荧光假单胞菌
- 利用定点突变法研究精氨酸脱亚胺酶活性的影响机制被引量：2
- 2012年
- 精氨酸脱亚胺酶(ADI)是一种针对精氨酸缺陷型癌症(如:肝癌、黑素瘤)的新药,目前处于临床三期试验。文中通过定点突变技术分析了精氨酸脱亚胺酶的特定氨基酸位点对酶活力的影响机制。针对已报道的关键氨基酸残基A128、H404、I410,采用QuikChange法进行定点突变,获得ADI突变株M1(A128T)、M2(H404R)、M3(I410L)和M4(A128T/H404R)。将突变株在大肠杆菌BL21(DE3)中进行重组表达,并对纯化获得的突变蛋白进行酶学性质研究。结果表明,突变位点A128T和H404R对ADI最适pH的提高,生理中性(pH 7.4)条件下的酶活力和稳定性的提高,以及Km值的降低均具有显著的作用。研究结果为阐明ADI的酶活力影响机制和蛋白质的理性改造提供了一定的依据。
- 李利锋倪晔孙志浩
- 关键词：精氨酸脱亚胺酶定点突变蛋白质纯化酶活力最适PH抗癌
- 尿素-溴化钙联用分离制高纯度间甲酚被引量：6
- 2011年
- 以物质的量之比为66.8:33.2的间甲酚和对甲酚的混酚为原料,采用尿素络合法分离间甲酚。以与间甲酚等物质的量的甲苯为溶剂,在尿素与间甲酚物质的量之比为1.4的条件下分离后,间甲酚回收率为65%,纯度为99%。采用溴化钙络合法对尿素法分离间甲酚所产生的废液进行再次分离,得到混酚原料,然后采用尿素法进一步分离,间甲酚的回收率可由65%提高至85%左右。
- 侯颖眭贤明杨立荣吴坚平徐刚
- 关键词：间甲酚尿素
- 腈水合酶NHaseK在大肠杆菌中的功能表达被引量：1
- 2016年
- 腈水合酶由α亚基和β亚基组成,活化元件对其功能表达至关重要,研究腈水合酶基因簇中各元件的表达比例对酶重组表达的影响具有重要意义。以来源于Klebsiella oxytoca KCTC 1686的腈水合酶（NHaseK）为研究对象,构建了多种表达策略,以期实现α亚基、β亚基和活化元件17k差异表达。利用pETDuet-1质粒具有双T7启动子的特点,将上述基因以八种不同的组合方式分别插入于两个启动子之后。当将三段基因同时插入于第一个启动子之后时,亚基表达量均衡,比活力为0.78 U/mg蛋白,是亚基表达量比例为5∶3时的124%。在此基础上,在第二个启动子之后插入活化元件基因,活化元件表达水平提升2倍,比活提升5%,为0.82 U/mg蛋白。当将α亚基和β亚基插入于不同启动子之后时,酶活仅为对照组的10%,说明NHaseK的亚基必须同时转录才可形成成熟蛋白。进一步考察质粒拷贝数对大肠杆菌表达NHaseK的影响,确定15~20的质粒拷贝数足够实现NHaseK的功能表达。结果表明,亚基的均衡表达以及活化元件的充分表达对NHaseK的重组表达具有积极作用。
- 王丽燕王煜吴坚平徐刚杨立荣
- 关键词：腈水合酶双启动子质粒拷贝数
