国家自然科学基金(30270520)
- 作品数：11 被引量：31H指数：4
- 相关作者：周玲曾毅左建民王琦唐安洲更多>>
- 相关机构：中国疾病预防控制中心汕头大学广西医科大学第一附属医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划国家重点基础研究发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 含EBV-LMP2基因重组腺病毒修饰的树突状细胞疫苗体内外特异性抗瘤作用的研究
- 2005年
- 左建民周玲杜海军付华王琦曾毅
- 关键词：重组腺病毒LMP2CTL树突状细胞抗原呈递细胞
- 去除致癌基因的EB病毒潜伏膜蛋白1的重组腺病毒的构建及其免疫效果被引量：1
- 2003年
- 为进一步研究利用EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)进行免疫治疗的可行性,构建了含有去除致癌基因的EB病毒LMP1片段(LMP1△)的穿梭质粒pAdTrack CMV LMP1△,将它与腺病毒骨架质粒pAdEasy 1用电转染的方法共同导入大肠杆菌BJ5183中,在宿主菌重组酶的介导下进行同源重组。通过抗性筛选,获得含有重组腺病毒基因的质粒;然后再通过脂质体将重组腺病毒质粒导入腺病毒包装细胞HEK293细胞中,在HEK293细胞E1蛋白的反式作用下,病毒被包装。将包装病毒的细胞裂解上清进行PCR鉴定证实,病毒DNA中含有目的基因的特异性片段。RT PCR证明了外源基因在真核细胞中得以转录,免疫酶和Westernblot的结果也显示,LMP1△蛋白在真核细胞得到表达。将扩增后的病毒感染HeLa细胞,测定病毒滴度为3.0×109PFU/ml。为初步探讨其免疫效果,采用肌肉注射和滴鼻的方式感染Balb/c纯系小鼠,免疫酶检测其特异性抗体,LDH法检测特异性CTL的杀伤作用,结果发现,两种免疫途径均可诱发小鼠针对LMP1的特异性体液免疫和细胞免疫,而且Ad5作为免疫对照组的小鼠则没有引起相应的免疫反应。
- 贾俊岭周玲左建民王琦曾毅
- 关键词：致癌基因EB病毒潜伏膜蛋白1重组腺病毒免疫效果
- EB病毒潜伏膜蛋白2的研究回顾被引量：1
- 2003年
- 左建民周玲曾毅
- 关键词：EB病毒潜伏膜蛋白2免疫抑制肿瘤免疫治疗
- EB病毒LMP1 C-端序列缺失对细胞增殖的影响
- 2006年
- 潜伏膜蛋白1(Latent membrane protein 1,LMP1)是由γ疱疹病毒亚科的EB病毒基因编码的能够使正常细胞发生恶性转化的跨膜信号蛋白,C-端为LMP1的主要功能区。通过PCR从B95-8细胞和鼻咽癌活检组织中获得lmp1和lmp1 C-端30bp缺失(lmp1 C-terminal deleted,lmp1-ctd)基因;利用体外基因重组技术,将lmp1和lmp1-ctd分别插入AAV质粒载体中;应用Lipofectamine介导转染HEK-293包装细胞,获得含lmp1和lmp1-ctd的rAAV;再以rAAV感染猴肾上皮细胞。利用RT-PCR检测lmp1和lmp1-ctd在猴肾上皮细胞中的转录;MTT法、流式细胞仪技术检测细胞生长和DNA合成,探讨lmp1和lmp1-ctd对其在细胞中活性的影响。结果显示:lmp1在转化细胞中转录,导致细胞生长速度加快,其中lmp1-ctd转化细胞的生长速度和处于增殖期比例高于lmp1转化细胞。提示lmp1-ctd较lmp1具有更强的促细胞增殖作用。
- 杜海军赵健周玲王琦李红霞曾毅
- 关键词：EB病毒潜伏膜蛋白1细胞增殖
- EBV-LMP2基因密码子优化对其蛋白表达及免疫效果的影响被引量：3
- 2004年
- 为了研究对EBV LMP2基因按照真核密码子偏好进行密码子优化后 ,对其在真核细胞蛋白表达水平以及引发细胞免疫能力的影响 ,我们对EBV LMP2基因进行了完全改造 ,并构建了改造前后的Psectag/LMP2重组质粒 ,通过瞬时转染COS 7细胞检测其蛋白表达并进行了小鼠的DNA疫苗实验。结果表明 ,改造后的LMP2基因在真核细胞中的表达未见大幅提高 ,同时引发细胞免疫的能力也没有明显上升。结果提示 ,我们单纯按照密码子的偏好来改造基因并不一定能使蛋白的表达量和引发免疫反应的能力提高。
- 左建民周玲王琦曾毅
- 关键词：密码子优化LMP2瞬时转染CTL
- Ad5F35重组腺病毒载体研究进展被引量：6
- 2006年
- 莫武宁唐安洲周玲
- 关键词：重组腺病毒载体外源基因生物学领域理化性质分离纯化基因片段
- 冻融人树突状细胞基因疫苗体外抗肿瘤免疫效应被引量：5
- 2007年
- 目的:观察人外周血和人脐血来源的冻融树突状细胞(dendritic cell,DC)基因疫苗的形态、表型及体外诱导的CTL抗肿瘤活性。方法:细胞因子扩增人外周血和脐血DC,分别将EBV-LMP2、HPV16E6基因转染2种来源的冻融DC制备疫苗。动态形态学观察和流式细胞术检测疫苗表面分子表达,体外诱导并测定CTL活性。结果:人外周血和脐血冻融DC疫苗均高表达CD80、CD86和CD83,低表达CD14,高表达CD1a,体外均能诱导高效的CTL活性(P=0·001),并与新鲜DC疫苗差异无统计学意义,P=0·138。结论:负载肿瘤相关病毒抗原基因的冻融DC疫苗保持了功能成熟DC的形态特征,且能诱导高效的特异性抗肿瘤免疫应答。
- 任会均张锦堃周玲左建民魏锡云曾毅
- 关键词：树突细胞疫苗
- 冻融人外周血树突状细胞基因疫苗体外抗肿瘤活性研究被引量：1
- 2009年
- 目的观察EB病毒潜伏膜蛋白重组腺病毒(rAd-EBV-LMP2)转染的冻融人外周血树突状细胞(DC)诱导的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)抗肿瘤活性。方法人外周血来源的单核细胞经细胞因子扩增培养为成熟DC,液氮冻存;rAd-LMP2重组腺病毒转染冻融DC制备疫苗。动态观察细胞形态学特征,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测DC疫苗刺激同种T淋巴细胞增殖活性,以及诱导的CTL对肿瘤细胞的杀伤活性。结果rAd-LMP2转染的冻融DC疫苗具有形态迥异、多突起的典型形态学特征,其刺激同种T淋巴细胞的增殖能力明显高于对照组(P<0.01),能诱导高效的CTL活性(P<0.01),与新鲜DC疫苗差异无统计学意义(P>0.05)。结论rAd-LMP2转染冻融DC疫苗在体外能激发较强的EBV-LMP2特异性的功能性CTL,为EBV相关的鼻咽癌(NPC)的免疫治疗提供策略。
- 盘鹰何小英张鲁勉郑锦鸿
- 关键词：鼻咽肿瘤疫苗
- 含EBV-LMP2基因重组腺病毒疫苗的构建及其诱导CTL应答的初步探讨被引量：9
- 2003年
- 目的 构建包含EBV LMP2基因的重组腺病毒疫苗并探讨它在体内外的免疫性质。方法 采用pAdeasy 1系统构建包含EBV LMP2基因的重组腺病毒疫苗 ,并用IFA、PCR和TCID50 等方法对其特异性进行鉴定。通过重组腺病毒感染人树突状细胞 (DC) ,在体外活化自体T细胞 ;以及通过重组腺病毒感染小鼠淋巴细胞 ,皮下免疫同种小鼠 ,体内活化CTL评价其免疫效果。结果 通过PCR以及间接免疫荧光试验分别证实了病毒目的基因LMP2的存在以及蛋白在 2 93细胞中的表达。采用TCID50 方法 ,测定第 6代的病毒滴度为 2× 10 8。体内外的免疫实验结果显示通过这两种方式均可以有效地引发针对EBV LMP2的CTL反应。结论 包含EBV LMP2基因的重组腺病毒疫苗可以在体内外有效地引发CTL应答 ,这些资料为下一步临床应用含LMP2的重组腺病毒作为疫苗治疗和预防EBV相关肿瘤奠定了基础。
- 左建民周玲王琦曾毅
- 关键词：EBV病毒潜伏膜蛋白2CTL反应
- Ad5F35-LMP2重组腺病毒的构建及鉴定被引量：4
- 2007年
- 目的构建Ad5F35-LMP2重组腺病毒。方法分别以EcoRⅠ单酶切pSH-LMP2和pDC316,将LMP2目的基因片段和线性化的pDC3l6连接,克隆构建pDC3l6-LMP2,以PCR和酶切的方法鉴定插入方向正确。pDC3l6-LMP2与腺病毒骨架pBHG-fiber5/35共转染293细胞构建重组腺病毒Ad5F35-LMP2,PCR及间接免疫荧光进行鉴定。结果经PCR和酶切鉴定证实pDC3l6-LMP2构建成功。pDC3l6-LMP2与腺病毒骨架共转染293细胞后见明显的毒斑,说明二者在293细胞中同源重组并包装成功。经PCR证实重组腺病毒Ad5F35-LMP2构建完成,间接免疫荧光鉴定LMP2蛋白能在细胞膜上有效表达。结论本实验成功构建了含EB病毒LMP2全序列的Ad5F35-LMP2重组腺病毒,为下一步进行该重组病毒生物安全性能和生物学功能研究及今后应用Ad5F35-LMP2重组腺病毒对鼻咽癌患者进行基因免疫治疗奠定了基础。
- 莫武宁周玲吴小兵王湛唐安洲黄光武曾毅
- 关键词：鼻咽癌重组腺病毒基因免疫治疗
