福建省自然科学基金(2006J0349)
- 作品数：2 被引量：3H指数：1
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- 增强型绿色荧光蛋白和大鼠血管生长素-1基因共表达的重组慢病毒体外转染大鼠骨髓间充质干细胞
- 2009年
- 目的:观察共表达的血管生成素-1(Ang-1)基因和增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的重组慢病毒体外转染大鼠骨髓间充质干细胞(rMSC).方法:体外包装Ang-1基因和EGFP基因共表达的重组慢病毒,测定病毒滴度.转染rMSCs,荧光显微镜下观察EGFP的表达、转导效率,实时荧光定量PCR,Western blot分别在不同时间点行Ang-1基因mRNA以及蛋白表达的相对定量分析.将转染的rMSCs(Ang-1-rMSCs)与对照组rMSCs培养48 h的上清液分别与人脐带静脉内皮细胞(HUVECs)共培养,MTT法检测HUVECs的吸光度值.结果:包装的浓缩慢病毒,滴度为6.1×1010TU/L.转染rMSCs,5 d转染效率为(92.7±3.01)%;实时荧光定量PCR和Western Blot结果显示Ang-1-rMSCs中Ang-1基因mRNA及蛋白表达水平均以转染后3～7 d为高峰,随后开始呈缓慢下降趋势.Ang-1-rMSCs与HUVECs共培养,与对照组rMSCs比较,MTT法检测显示Ang-1-rMSCs能明显促进HUVECs的增殖(P<0.01).结论:在体外重组的慢病毒成功转染rM-SCs,其Ang-1基因表达以转染后3～7 d为高峰,且转染的rMSCs具有Ang-1基因的生物学活性.
- 张阳张志坚陈柏龄陈东平吴秀丽
- 关键词：ANG-1慢病毒转染
- EGFP和大鼠GDNF基因共表达的慢病毒载体构建及转染大鼠骨髓间充质干细胞被引量：3
- 2009年
- 为了构建携带增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)和胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)基因的慢病毒载体,观察GDNF基因大鼠骨髓间充质干细胞(rat mesenchymal stem cells,rMSC)的表达,本研究采用RT-PCR(reverse transcription-PCR)方法从P0大鼠小脑组织中扩增出GDNF基因编码区636 bp的片段,通过限制性内切酶酶切、T4DNA连接酶连接,将GDNF插入慢病毒转移载体PNL-IRES2-EGFP,构建PNL-GDNF-IRES2-EGFP。在脂质体介导下将构建成功的慢病毒三质粒系统共转染人胚肾细胞系(293T)包装生产慢病毒,测定病毒滴度。感染rMSCs,荧光显微镜下观察EGFP的表达、转导效率,RT-PCR、Western blot方法分别检测GDNF mRNA和蛋白的表达情况。结果显示:GDNF的基因序列经测序后与GeneBank报道的序列完全一致,重组慢病毒载体质粒PNL-GDNF-IRES2-EGFP经双酶切鉴定正确;三质粒共转染293T细胞后荧光激发可见大量绿色荧光,收集、浓缩病毒后测定其滴度为5.3×107pfu/ml;感染rMSCs结果显示:GDNF-rMSCs组5 d转导效率为93.3%±3.17%,传代培养4周,下降到81.1%±3.59%,差异具有统计学意义(P<0.01)。RT-PCR(real time-PCR)、Western blot显示GDNF成功在rMSCs中表达。本结果表明,我们已经成功构建带有EGFP、GDNF基因的慢病毒载体,并获得GDNF-rMSCs基因工程细胞,但提高该工程细胞外源基因的稳定表达技术仍需进一步探讨。
- 张阳张志坚陈东平吴秀丽
- 关键词：GDNF慢病毒载体转染
