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一种大鼠肝癌干细胞的离心富集方法被引量：2: 2012年; 目的建立一种富集大鼠肝癌干细胞的方法，并检测此种方法分离得到的细胞是否具有肿瘤干细胞的生物学特征。方法二乙基亚硝胺（DENA）腹腔注射构建大鼠肝癌模型，两步胶原酶灌注法分离肝癌细胞并体外培养，Percoll连续梯度密度离心法将细胞分成4层，采用流式细胞仪检测各层细胞的肝癌干细胞表面标志上皮细胞黏附因子（EpCAM）、甲胎蛋白（AFP）的表达，并用实时一聚合酶链反应（ReM—timePCR）验证EpCAM、CDl33、AFP的mRNA表达。绘制生长曲线检测各层细胞增殖能力，Transwell小室检测各层细胞的侵袭能力。结果Percoll离心所得4层细胞中，第3层细胞是富集肝癌干细胞最多的一层，具有最强的增殖能力。第3层细胞EpCAM与AFP阳性表达最高，分别为（84．50±8．31）％和（85．20±8．31）％，与其他各层比较，差异有统计学意义（P〈0．05）。经ReM—timePCR验证，第3层细胞的EpCAM和AFPmRNA表达最高，分别为（111．34±5．59）和（13．76±0．95），与其他各层比较，差异有统计学意义（P〈0．05），第3层的CD133表达为（17．16±0．42），与第2层、4层比较，差异有统计学意义（P〈0．05），但与第1层比较，差异无统计学意义（P〉0．05）。侵袭实验可见第3层细胞穿透的数量最多（92．750±4．432），与其他各层比较，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论利用Percoll连续梯度密度离心法成功地富集了肝癌干细胞，经验证符合肿瘤干细胞生物学特性，为肝癌的靶向治疗、多重耐药等基础研究提供了确切的研究对象。; 王兴刘卫辉夏宁张娟杨建栋王涛尤楠龚振斌季茹赵戈窦科峰; 关键词：肝细胞干细胞细胞分离

绿色荧光蛋白转基因小鼠胎肝干细胞在体内外定向分化的潜能被引量：1: 2014年; 目的探讨绿色荧光蛋白转基因小鼠胎肝干细胞（FLSCs）在体内及体外定向分化的潜能。方法取孕13d绿色荧光蛋白（GFP）转基因C57BL／6J小鼠胚胎肝脏，经机械消化和胶原酶消化获得FLSCs并扩大培养；成熟肝细胞来自于同品系小鼠成体肝脏，通过两步灌注胶原酶消化法提取，流式细胞仪鉴定其干细胞标志物的表达及自我增殖能力，RT—PCR及Westernblot测定AFP表达；分别将FLSCs经肝细胞生长因子（HGF）及TGF-β诱导分化后，Real—timePCR检测Alb、角蛋白CK一7、8、19mRNA以及Westernblot检测Alb、角蛋白CK-7、8、19蛋白在诱导前后的表达变化，鉴定其向肝细胞和胆管细胞双向分化的能力；经尾静脉注射FLSCs到野生型C57BL／6J肝切除小鼠体内，观察其在肝内重构肝组织的能力。计量资料采用t检验，各时相点比较采用重复测量的方差分析，两两比较采用LSD—t检验。结果成功克隆FLSCs细胞。流式细胞仪检测分离的FLSCs表达上皮细胞黏附分子（EpCAM）、CDl33、CD49f干细胞标志物，其阳性表达率分别为78．6％±3．3％、31．7％±2．5％、47．6％±1．8％。AFPmRNA在FLCs和成熟肝细胞中的相对表达量分别为0．640±0．115和0．053±0．012，蛋白相对表达量分别为1．3834±0．265和0．243±0．227，两者比较，差异有统计学意义（t=8．772，5．354，P〈0．05）。超低黏附培养皿培养FLPCs和成熟肝细胞，其形成克隆球数目分别为（234．04±57．0）个和（5．04±2．0）个，两者比较，差异有统计学意义（t=12．711，P〈O．05）。体外HGF诱导FLSCs分化，Alb、CK-8mRNA表达分别在8、10d到达峰值，分别为0．851±0．030和0．771±0．031；两者蛋白水平于第10天达峰值，分别为4．573±0．015和1．562±0．029。体外TGF—B诱导FISCs分化，CK-7、CK-19mRNA在第12天达峰值，分别为15．454±2．152和10．675±1．822；两者蛋白水平于第14天达峰�; 黄启科党立力阮柏张卓超刘杰王兴郑志刚陶开山; 关键词：胎肝干细胞示踪

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国家自然科学基金(81170419)

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