国家自然科学基金(30871294)
- 作品数：9 被引量：14H指数：2
- 相关作者：王桂玲王孝会陈薇姜佩佳宋艳艳更多>>
- 相关机构：中国医科大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金辽宁省自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- C／EBPα不同截短功能域GST融合蛋白表达载体的构建及表达的研究
- 2011年
- 目的构建GST-C/EBPα融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)中诱导表达。方法以质粒pcDNA3.1-C/EBPα为模板,用PCR法扩增C/EBPα全长及各个截短片段,通过EcoRI和XhoI酶切位点将C/EBPα全长及各个截短突变体定向插入pGEX-5X-1中,构建原核表达质粒pGEX-5X-1-C/EBPα及其截短突变体,并转化E.coli DH5α,筛选阳性重组子,限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列测定正确后,转入E.coli BL21中,异丙基硫代β-D半乳糖苷诱导表达,SDS-PAGE和SDS-PAGE鉴定。结果酶切及测序结果证明,成功构建了原核表达质粒pGEX-5X-1-C/EBPα及其截短突变体,并用SDS-PAGE方法证实了GST-C/EBPα全长及各个截短突变体融合蛋白的表达。结论成功构建了C/EBPα原核表达载体及其截短突变体,并证实了融合蛋白的表达,为进一步纯化C/EBPα蛋白和研究C/EBPα的生物学功能奠定了基础。
- 王桂玲陈薇姜佩佳王孝会
- 关键词：质粒原核表达
- 组蛋白脱乙酰化酶GST-HDAC1融合蛋白载体的构建及其在大肠杆菌中的表达被引量：1
- 2011年
- 目的构建GST-HDAC1融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)中诱导表达。方法以质粒pcDNA3.1-HDAC1为模板进行PCR,通过EcoR1单酶切位点将HDAC1插入pGEX-5X-1中,构建原核表达质粒pGEX-5X-1-HDAC1,并转化E.coli DH5α,通过利用载体上的BamH1酶切位点和HDAC1上Nde1酶切位点来筛选阳性重组子,DNA序列测定正确后,转入化E.coli BL21中,异丙基硫代β-D半乳糖苷诱导表达,鉴定。结果酶切后获得940bp片段为正向;如获得500bp片段为反向。重组质粒测序后与GenBank进行同源性比对证明导入片段为HDAC1,成功构建了原核表达质粒pGEX-5X-1-HDAC1,并用SDS-PAGE方法证实了GST-HDAC1融合蛋白在大肠杆菌中的表达。结论成功构建了HDAC1原核表达载体,并证实了融合蛋白在大肠埃希菌中的表达,为进一步纯化HDAC1蛋白及与其它蛋白的关系奠定了基础。
- 王桂玲陈薇王孝会姜佩佳
- 关键词：原核表达
- GST／RIPX融合蛋白表达载体的构建及其在大肠埃希菌中的表达被引量：3
- 2010年
- 目的构建GST/RIPX融合蛋白基因表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)中诱导表达。方法以质粒pcDNA3.1-RIPX为模板,通过BamH1和Xho1酶切位点将RIPX定向插入pGEX-4T-2中,构建原核表达质粒pGEX-4T-2-RIPX,并转化E.coli DH5α,筛选阳性重组子,限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列测定正确后,转入化E.coli BL21中,异丙基硫代β-D半乳糖苷诱导表达,鉴定。结果酶切及测序结果证明,成功构建了原核表达质粒pGEX-4T-2-RIPX,并用SDS-PAGE方法证实了GST/RIPX融合蛋白的表达。结论成功构建了RIPX原核表达载体,并证实了融合蛋白的表达,为进一步纯化RIPX蛋白和研究RIPX的生物学功能奠定了基础。
- 王孝会王桂玲
- 关键词：质粒融合蛋白
- RUNX3全长和不同结构域原核表达载体的构建及其重组蛋白表达
- 2013年
- 目的:构建RUNX3全长和不同结构域的原核表达载体并表达其重组蛋白。方法:以pcDNA3.1-myc-RUNX3为模板,采用PCR法扩增RUNX3全长和各个结构域片段,通过EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点将RUNX3全长和不同结构域定向插入谷胱甘肽转移酶(GST)融合表达载体pGEX-4T-2中,在大肠杆菌(E.coli)BL21中诱导其融合蛋白表达,SDS-PAGE电泳检测其蛋白表达情况。结果:EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后得到与预期大小相符的FL(1 245bp)、ΔRunt(843bp)、Nter(159bp)、Runt(402bp)和Cter(684bp)5个载体片段。SDS-PAGE电泳检测,RUNX3全长及各个结构域截短GST-RUNX3截短融合蛋白(GST-FL、GST-Runt、GST-Nter和GST-Cter)相对分子质量分别为72 000、40 000、32 000和51 000。结论:成功构建RUNX3全长和各个结构域截短的GST标签的原核表达载体,并实现其重组蛋白在原核细胞中的表达。
- 宋艳艳王桂玲
- 关键词：RUNX3蛋白诱导蛋白表达
- 原核表达载体GST-RUNX3的构建及其在大肠杆菌表达
- 2011年
- 目的构建GST/RUNX3融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)中诱导表达。方法利用Kpn1和Xho1位点酶切pcDNA3.1-RUNX3质粒,将获得的1300bpRUNX3编码序列插入到pGEX-4T-2中,构建pGEX-4T-2-RUNX3质粒,并转化E.coli DH5α,筛选阳性重组子,酶切鉴定和DNA序列测定正确后,转入BL21中,经IPTG诱导表达后SDS-PAGE电泳鉴定。结果酶切pGEX-4T-2-RUNX3质粒获得1300bpRUNX3片段,经测序后获得的DNA序列与GenBank进行同源性比对,证实pGEX-4T-2-RUNX3构建成功。在E.coli BL21用IPTG进行诱导表达后,SDS-PAGE电泳方法证实了GST-RUNX3融合蛋白表达。结论成功构建了RUNX3原核表达载体,其融合蛋白在大肠埃希菌表达,为进一步纯化RUNX3蛋白和研究RUNX3的生物学功能奠定了基础。
- 王桂玲王孝会都田赵陈薇姜佩家
- 关键词：原核表达融合蛋白大肠埃希菌
- Flag标签MORC2-677丝氨酸位点突变载体构建及表达被引量：2
- 2012年
- 构建Flag标签pcDNA3.1-MORC2的677丝氨酸位点突变重组质粒并完成在SGC-7901细胞中表达,更好地研究677丝氨酸位点所发生的功能.首先,构建含有KpnⅠ和XhoⅠ酶切位点Flag标签的pcDNA3.1空载体;再以含有KpnⅠ和XhoⅠ酶切位点的pcDNA3.1A-MORC2-WT野生型质粒为模板,在S677突变位点两侧设计重叠突变引物,进行三轮重叠延伸PCR完成定点突变,获得MORC2全长编码序列的S677位点的定点突变体载体(pcDNA3.1A-MORC2-S677A/S677E);再通过KpnⅠ和XhoⅠ酶切把pcDNA3.1A-MORC2-WT/S677A/S677E各载体定向克隆到已构建好的pcDNA3.1-Flag空载体中,酶切鉴定及测序正确后,转染到SGC-7901细胞中,利用Flag–标签抗体,Western blot检测其各突变载体的表达.成功构建了人Flag标签MORC2全长编码序列S677位点突变体真核表达载体并在SGC-7901细胞中获得带Flag标签融合蛋白表达产物,为进一步研究MORC2的功能奠定了基础.
- 王桂玲王孝会程正国宋艳艳李丰
- 关键词：突变体真核表达载体基因表达胃癌细胞
- 曲妥珠单抗治疗HER2阳性乳腺癌的耐药机制及新疗法探索被引量：8
- 2012年
- 研究表明大约有20%的乳腺癌患者存在HER2过表达现象。HER2的异常表达及异常信号通路与乳腺癌的侵袭转移、治疗抵抗及不良预后密切相关。在临床上,对于HER2阳性的初期乳腺癌患者常联合曲妥珠单抗及化学药物治疗,但部分患者对曲妥珠单抗产生耐药。因此,研究其耐药机制对于HER2阳性乳腺癌患者的治疗、预后及新疗法的探索具有重要的临床意义。目前引起曲妥珠单抗抵抗的主要机制有:p95-HER2累积、PI3K/AKT/mTOR信号异常激活、HER家族受体和IGF-1R信号增加、非受体酪氨酸激酶c-SRC活性增加等。将对上述机制及治疗HER2阳性乳腺癌的新疗法进行综述。
- 任毅行王桂玲
- 关键词：HER2阳性乳腺癌曲妥珠单抗治疗耐药机制PI3K/AKT/MTORIGF-1RC-SRC
- 胃癌SGC-7901细胞中人RIPX—GFP融合蛋白载体构建及表达定位
- 2011年
- 目的构建真核表达载体pEGFP—RIPX，并鉴定RIPX在胃癌细胞中的定位，并检测外源性RIPX的表达。方法以pBluescriptR—RIPX为模板，采用PCR法进行人RIPX编码序列（CDS）的扩增，并将其克隆至真核表达载体pEGFP—C1中。将pEGFP—RIPX质粒瞬时转染到胃癌SGC-7901细胞中，用Western印迹方法检测GFP—RIPX融合蛋白的表达；用激光扫描共聚焦显微镜观察RIPX的定位。结果人的RIPX编码序列被成功克隆至真核表达载体pEGFP—C1中；证实了GFP—RIPX融合蛋白的表达；转染pEGFP．RIPX后，在胃癌SGC-7901细胞胞质内可见明亮的绿色荧光。结论成功地构建了pEGFP-RIPX载体，鉴定了外源性RIPX的表达；同时证实在胃癌SGC-7901细胞中RIPX主要定位于细胞质，为进一步研究RIPX的生物学特性及其信号转导通路奠定了基础。
- 王桂玲王孝会周颖陈薇姜佩佳
- 关键词：绿色荧光蛋白胃癌SGC-7901细胞
- 原核表达载体GST-RUNX3的构建及其在大肠杆菌中的表达
- 2011年
- 目的构建GST/RUNX3融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)中诱导表达。方法以质粒pcDNA3.1-RUNX3为模板,通过Kpn1和Xho1酶切位点将RUNX3定向插入pGEX-4T-2中,构建原核表达质粒pGEX-4T-2-RUNX3,并转化E.coliDH5α,筛选阳性重组子,限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列测定正确后,转入E.coliBL21中,异丙基硫代β-D半乳糖苷诱导表达,鉴定。结果双酶切获得1300bp片段,证明RUNX3片段被成功导入pGEX-4T-2,并在测序后与GenBank进行同源性比对,比对进一步证实原核表达质粒pGEX-4T-2-RUNX3构建成功,并用IPTG诱导,SDS-PAGE方法证实了GST/RUNX3融合蛋白在大肠杆菌中的表达。结论成功构建了RUNX3原核表达载体,并证实了融合蛋白在大肠埃希菌中的表达,为进一步纯化RUNX3蛋白和研究RUNX3的生物学功能奠定了基础。
- 王桂玲王孝会都田赵陈薇姜佩家
- 关键词：质粒原核表达融合蛋白
