国家自然科学基金(30400376)
- 作品数：8 被引量：18H指数：3
- 相关作者：尹一兵张雪梅胥文春王虹李南更多>>
- 相关机构：重庆医科大学重庆医科大学附属第二医院重庆医科大学附属第一医院更多>>
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- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 肺炎链球菌转化模型的建立被引量：6
- 2008年
- 目的:建立一种更加稳定、高效的肺炎链球菌实验室转化模型,以便于对该菌的各种目的基因进行重组改造.方法:分别用改进方法和既往方法制备肺炎链球菌感受态细胞,转化外源DNA,获取发生了转化的菌株,通过抗生素培养基培养和PCR鉴定是否发生转化;并计数抗生素筛选平板上的转化菌落,比较两者的转化率,以确定更佳的转化模型.结果:肺炎链球菌334菌株、31203菌株用改进方法的转化率分别为(0.89±0.20)%,(0.71±0.10)%,高于既往方法的转化率[分别为(6.2±1.4)×10-3%,(5.7±1.1)×10-3%],构建了肺炎链球菌感受态缺陷菌株,建立了改进的肺炎链球菌实验室转化模型.结论:改进的转化模型实现了稳定的肺炎链球菌实验室转化,能方便研究者对该菌进行各种遗传操作,为深入研究其致病的分子机制提供了一个技术平台.
- 赵清李南张雪梅胥文春朱兴华张群尹一兵
- 关键词：肺炎链球菌细菌感受态
- 肺炎链球菌转化模型的建立与优化被引量：4
- 2006年
- 建立肺炎链球菌转化模型，优化转化体系，提高转化率，以便于进一步研究其致病的分子机制。制备肺炎链球菌感受态。首先在不同菌密度下转化外源DNA，计数抗生素筛选平板上的转化菌落，比较其转化率，确定转化的最适菌密度；然后在此菌密度下比较CSP诱导不同时相的转化率，同时用RT-PCR检测感受态调控基因comE的表这。对所用血清3型菌株而言转化的最适菌密度在OD550=0．09～0．10之间；CSP-2诱导10min后转化率最高，可达（15．6±3）％；comE的表达也在CSP-2诱导10min后达到最高。在实验室条件下。肺炎链球菌转化受多种因素的影响，必需控制好各种因素。选择最优条件才能获得稳定、高效的转化。
- 孟江萍尹一兵张雪梅蓝锴黄远帅涂植光
- 关键词：肺炎链球菌感受态
- 肺炎链球菌候选蛋白疫苗ClpP的保守性和抗原性被引量：2
- 2008年
- 目的:评价酪蛋白裂解酶P(ClpP)作为候选疫苗的保守性和抗原性,分析在不同血清型肺炎链球菌(SPN)中的表达情况.方法:以TIGR4型SPN的ClpP基因序列设计引物,分别以12株不同血清型SPN的基因组DNA为模板,对ClpP基因进行聚合酶链反应(PCR)扩增、胶回收产物与PMD-18克隆载体连接后进行测序,运用生物信息学方法对其核苷酸及推测的氨基酸序列及抗原性进行分析,并利用West-ernBlot方法检测12株不同血清型SPN的ClpP蛋白的表达情况.结果:12株不同血清型SPN的ClpP基因序列和Gen-Bank数据库对已公布的TIGR4型SPN的ClpP基因一致性>99.0%,推测的氨基酸序列一致性>99.5%.WesternBlot结果显示anti-ClpP多克隆抗体与12型SPN的菌体蛋白能够起交叉反应.结论:ClpP蛋白在不同型SPN之间同源性高,在不同型SPN菌株中均有表达.ClpP是一个具有前景的SPN候选蛋白疫苗因子.
- 李岱容曹炬王虹吴凯峰尹一兵
- 关键词：肺炎链球菌抗原性
- comE基因缺陷影响肺炎链球菌体内诱导基因的表达
- 2010年
- 【目的】筛选受comE调控的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pn)体内诱导基因。【方法】通过插入失活构建基因comE缺陷的S.pn菌株,与野生菌株分别腹腔注射BALB/c小鼠,经过体内诱导后取小鼠血,分离细菌提取RNA,用RT-PCR法检测13个体内诱导基因mRNA水平差异。【结果】将RT-PCR结果通过Quantity-one灰度分析,进行配对t检验,显示8个体内诱导基因在缺陷菌株和野生菌株中mRNA表达水平具有统计学差异(P<0.05),其中spd-0300、spd-0414、spd-0622、spd-1663、spd-1719、spd-0235、spd-0873受转化上调,spd-1672受转化下调。【结论】筛选出受转化调控的体内诱导基因spd-0300、spd-0414、spd-0622、spd-1663、spd-1719、spd-0235、spd-0873、spd-1672,它们可能参与生长调节、温度感应、糖脂代谢等环节,表明细菌转化可通过调节某些体内诱导基因的表达来增强细菌的毒力。
- 刘鑫尹楠林张雪梅杨晓亮庞丹王虹尹一兵胥文春
- 关键词：肺炎链球菌COME毒力
- 肺炎链球菌绿色荧光蛋白报告质粒的构建及评价
- 2008年
- 目的:构建一个可高效报告基因表达的绿色荧光蛋白(Green fluorescence protein,GFP)报告质粒,为采用差异荧光诱导(Differential fluorescence induction,DFI)技术筛选肺炎链球菌(Streptoccus pneumoniae,S.pn)体内诱导的毒力基因奠定基础。方法:酶切质粒pGreenTIR的SD-ENH-GFP片段,将其插入含氯霉素抗性基因的自杀质粒pEVP3中,构建以绿色荧光蛋白为报告基因的自杀质粒pEVP3-SDGFP。再将肺炎链球菌的溶血素基因(Pneumolysin,ply)上游约500bp片段插入到该质粒报告基因上游的多克隆位点中,得到质粒pEVP3-SDGFP-Ply,将其转化入肺炎链球菌TIGR4中,比较新建质粒pEVP3-SDGFP与同样处理质粒pEGFP-1(报告基因gfp前无SD及ENH序列)报告上游基因表达的情况。结果:通过体内、外实验证实新建质粒pEVP3-SDGFP不但可以报告肺炎链球菌溶血素基因的表达,并且其报告上游基因表达的能力明显强于质粒pEGFP-1。结论:所构建的质粒pEVP3-SDGFP可用于DFI筛选肺炎链球菌体内诱导基因所需启动子诱捕文库的构建。
- 胥文春单幼兰许颂宵王虹陈淑惠尹一兵
- 关键词：肺炎链球菌绿色荧光蛋白报告质粒
- 肺炎链球菌毒力因子ClpP蛋白酶的体外表达及纯化被引量：5
- 2008年
- 目的构建ClpP原核表达载体,获取原核表达的ClpP蛋白分子。方法分离培养TIGR4型肺炎链球菌,获取其染色体DNA,采用基因体外重组的方法将完整的ClpP读码框克隆到pET-32a原核表达载体,并经测序鉴定,所表达的抗原蛋白用Western blot鉴定,镍柱纯化并透析复性,真空冷冻干燥保存。结果测序结果证实克隆的基因与GenBank中的序列相符,Western blot证实获得了ClpP融合蛋白。结论获得了高表达的重组抗原蛋白,经镍柱纯化后纯度可达90%以上。
- 袁军陈曜曹炬尹一兵
- 关键词：毒力因子肺炎链球菌
- 鼻腔滴注法建立小鼠肺炎链球菌性脑膜炎模型被引量：2
- 2008年
- 目的鼻腔滴注法建立小鼠肺炎链球菌性脑膜炎模型，为研究肺炎链球菌致脑膜炎的分子机制奠定基础。方法将冻存的TIGR4在新鲜TSA血平板上培养16h～18h后，刮取细菌并稀释成3种不同密度的菌液，每种密度分成2份，其中1份加入一定量的透明质酸酶，另1份不加。对小鼠行浅麻醉，用卡介苗注射器将上述菌悬液缓缓滴入小鼠鼻腔，待其自动吸入，每只小鼠50μl。每天观察小鼠情况，分别于感染后24、48和72h处死小鼠，取心脏血和一半脑组织匀浆，做细菌计数，另一半脑组织用于组织病理学检查。结果加透明质酸酶的TIGR4 3个剂量组小鼠脑膜炎发生率分别为20．00％、65．00％和46．67％，对照组分别为13．33％、53．33％和66．67％，差异无统计学意义（P=1．0000）；其中3×10^7 CFU组和3×10^4 CFU组差异无统计学意义（P=0．4621），两组合并后与3×10^6 CFU组差异有统计学意义（P=0．0196）。结论1）透明质酸酶不能促进鼻腔滴注TIGR4致小鼠脑膜炎的发生；2）小鼠脑膜炎的发生率与鼻腔感染TIGR4剂量有关，适宜剂量为3×10^7 CFU，低于该剂量脑膜炎的发生率显著降低。
- 胥文春单幼兰李南赵清张雪梅刘明芳尹一兵
- 关键词：肺炎链球菌脑膜炎
- ClpP融合蛋白诱导的免疫反应可抵抗不同型别肺炎链球菌的侵袭性感染
- 2008年
- 目的ClpP融合蛋白在调节肺炎链球菌其他毒力因子表达和入血过程中起重要作用，评价Trx—ClpP融合蛋白对不同型别肺炎链球菌的侵袭性感染的免疫保护效果，为后续蛋白疫苗的开发提供依据。方法含有重组质粒pET-32a（＋）／ClpP工程菌B121（DE3）经IPTG诱导后表达Trx—ClpP融合蛋白，纯化后与铝佐剂？昆合经腹腔注射免疫小鼠，而对照小鼠则用PBS与铝佐剂混合免疫。免疫程序：初次免疫5周后用ELISA法测小鼠针对ClpP融合蛋白的抗体免疫应答水平，末次免疫2周后用12个型别肺炎链球菌攻击，监测其生存时间。结果重组ClpP融合蛋白主动免疫BALB／c小鼠后，产生了高滴度的anti—ClpP融合蛋白抗体，对多个血清型的肺炎链球菌菌血症小鼠模型的保护效果较对照组具有统计学意义。结论ClpP融合蛋白免疫小鼠后可抵抗1、2、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F、23F等12个型别的肺炎链球菌侵袭性感染，提示以ClpP融合蛋白为活性成分的疫苗具有较高的开发价值。
- 李岱容王虹吴凯峰张雪梅尹一兵
- 关键词：肺炎链球菌疫苗
