教育部留学回国人员科研启动基金(BLH120499)
- 作品数：6 被引量：13H指数：2
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- 相关领域：生物学农业科学更多>>
- 水牛缝隙连接蛋白43基因克隆及表达被引量：2
- 2013年
- 本研究克隆了水牛缝隙连接蛋白43(connexin 43,Cx43)基因序列,并运用生物信息学方法对其核苷酸序列的保守性和氨基酸的理化性质、蛋白质结构进行了系统分析,对Cx43基因在水牛不同组织和不同发育阶段卵泡中的表达差异进行了检测。结果表明,应用RT-PCR技术克隆获得了水牛Cx43基因序列,其中编码区全长1152 bp,编码383个氨基酸,蛋白质理论分子质量43.13 ku,等电点为8.88。多重序列比对结果显示,水牛Cx43核苷酸序列与牛、羊、猪、马和人相应序列的同源性分别为99%、98%、94%、93%和92%,系统进化树分析结果推测,Cx43基因在不同物种进化过程中具有高度保守性;对水牛Cx43蛋白的二级和三级结构分析发现,其具有缝隙连接蛋白的特有结构。定量RT-PCR结果显示,Cx43在水牛卵巢组织中相对表达量最高,睾丸、肾脏、心脏和皮肤次之,肝脏和大脑表达量较低。免疫组化结果发现,Cx43蛋白表达随卵泡发育时期的不同而变化,Cx43蛋白随卵泡发育表达逐渐增强。
- 林浪龚云王梦屈春凤黄时海雷小灿石德顺李湘萍
- 关键词：水牛克隆
- 水牛YY1基因克隆及其shRNA片段的筛选被引量：7
- 2014年
- 本试验旨在克隆水牛阴阳因子1(YY1)基因,并筛选获得可有效抑制水牛YY1基因表达的shRNA干扰片段。以水牛成纤维细胞cDNA为模板,采用RT-PCR方法,扩增水牛YY1基因CDS序列,将其连接插入到pMD18-T载体中,进行序列测序并分析。采用Xho I和EcoR I双酶切,将水牛YY1基因编码区定向克隆至pEGFP-N1载体中,构建其真核表达载体pYY1-EGFP-N1。设计2条靶向水牛YY1基因的shRNA序列并构建其慢病毒表达载体,命名为pSicoR-GFP-YY1 shRNA1/2。以pSicoR-GFP和pSieoR-GFP-1864分别为空白对照和阴性对照质粒,采用脂质体转染方法,将YY1真核表达载体分别与2条shRNA慢病毒表达载体共转染293T细胞,48h后观察绿色荧光蛋白EGFP表达情况;72h收集共转染细胞样品,采用qRT-PCR和western-blot方法分析YY1基因的表达水平。结果表明,克隆得到1248 bp的水牛YY1基因CDS序列,其与牛YY1基因的同源性达99%。构建的水牛YY1基因真核表达载体pYY1-EGFP-N1能在水牛胎儿成纤维细胞(BFF)中瞬时表达。酶切分析及序列测定结果表明,所构建的shRNA慢病毒表达载体pSieoR-GFP-YY1 shRNA1/2为阳性克隆。质粒共转染293T细胞48h后,可观察到绿色荧光蛋白EGFP的表达。qRT-PCR结果显示,设计合成的2条shRNA对水牛YY1基因的表达均有抑制效果,其中YY1 shRNA2的抑制效果(93.64%)显著高于YY1 shRNA1(50.77%)(P<0.05),Western-blot分析结果显示,2条shRNA对YY1蛋白表达均有抑制效果。以上结果说明克隆得到水牛YY1基因编码区序列,并获得2条有效抑制其表达的shRNA片段,为进一步阐明YY1基因在水牛早期胚胎发育过程中的作用奠定了基础。
- 龚云乔树叶林浪王梦石德顺李湘萍
- 关键词：SHRNA慢病毒表达载体基因表达
- 水通道蛋白在哺乳动物卵泡发育过程中作用的研究进展
- 2015年
- 水通道蛋白(AQPs)是一类分布广泛的能促进水转运的小分子跨膜蛋白家族。作为细胞膜表面通道分子,水通道蛋白不仅对小分子类物质及水等有运输作用,还广泛参与哺乳动物生殖细胞发生及生殖调控等重要过程。研究发现,在哺乳动物卵泡发育过程中,卵泡形成和成熟、卵泡液的转运、窦腔形成、卵泡闭锁等均与水通道蛋白基因的表达及调节密切相关。文章对水通道蛋白基因及其在哺乳动物卵泡发育中的作用进行综述,并就其在卵泡发育及闭锁机制方面提出设想。
- 李胜屈春凤何金娜石德顺李湘萍
- 关键词：卵泡发育颗粒细胞雌激素
- 猪紧密连接蛋白1基因克隆及其shRNA片段的筛选
- 2016年
- 试验旨在筛选有效抑制猪紧密连接蛋白1(zonula occludens-1,ZO-1)基因表达的shRNA干扰片段,为后期利用RNA干扰技术深入了解ZO-1基因在猪卵母细胞成熟过程中的功能奠定基础。本研究首先克隆了猪ZO-1基因,并构建了其真核表达载体,而后筛选了有效抑制ZO-1基因表达的shRNA干扰片段。结果表明,猪ZO-1基因编码区长度为3 036bp,多重序列比对结果显示,猪ZO-1基因核苷酸序列与牛、羊、马和人相应序列的同源性分别为88%、88%、87%和85%。构建的pDsRed-N1-ZO-1真核蛋白融合表达载体经脂质体法转染HEK293T细胞后,可观察到清晰的RFP红色荧光蛋白表达。将靶质粒与shRNA干扰质粒共转染HEK293T细胞48h后,与对照组相比,可观察到红色荧光表达得到抑制。实时荧光定量PCR结果显示,设计合成的2条shRNA对猪ZO-1基因表达均有抑制效果,其中ZO-1shRNA201的抑制效果显著高于ZO-1shRNA1276(77.8%和67.0%,P<0.05)。
- 曹丽华王萍郝文艳代小丽陈培芳石德顺李湘萍
- 关键词：ZO-1基因克隆SHRNA
- 水牛水通道蛋白8基因克隆及表达分析被引量：4
- 2014年
- 本研究对水牛水通道蛋白8(aquaporin 8,AQP8)基因进行了克隆,并构建了真核表达载体,同时对AQP8基因在水牛卵巢组织中的表达进行了分析。结果发现,水牛AQP8基因编码区长度为732bp,与黄牛及小鼠AQP8基因的氨基酸序列同源性为100%。AQP8蛋白在不同发育阶段水牛卵泡中均有表达,在次级卵泡中的表达显著高于原始卵泡和初级卵泡(P<0.05),且集中表达于卵泡颗粒细胞。构建的pEGFP-N1-AQP8真核蛋白融合表达载体经脂质体法转染HEK293T细胞后,可观察到清晰的EGFP绿色荧光蛋白表达。该试验结果为深入研究AQP8基因在水牛卵泡发育及颗粒细胞凋亡中的功能奠定了基础。
- 李胜屈春凤李润何金娜石德顺李湘萍
- 关键词：水牛水通道蛋白8卵泡颗粒细胞
- 水牛GABA A型受体π亚基基因的克隆及其在乳腺组织中的表达
- 2016年
- γ-氨基丁酸(GABA)是大脑中一种重要的抑制性递质,除与兴奋的传递有关外,还在内分泌组织中发挥着重要的作用。本研究对水牛GABA A型受体的π亚基基因(GABRP)CDS序列进行了克隆,并对其进行了生物信息学分析,同时应用实时荧光定量PCR和免疫组化技术分析了GABRP基因在水牛乳腺组织中的表达情况。结果表明,应用RT-PCR技术成功获得了广西本地水牛GABRP基因序列,长为1 401bp;BLAST比对结果显示,广西本地水牛的GABRP核苷酸序列与和河流型水牛的同源性为99%,GABRP在不同物种中具有较高的保守性;GABRP蛋白主要在水牛乳腺组织的腺泡上皮细胞中表达,GABRP基因在泌乳期及非泌乳期水牛乳腺组织中都有表达,且非泌乳期GABRP基因的表达显著高于泌乳期(P<0.05)。试验结果为进一步研究GABRP基因在水牛乳腺发育过程中的功能奠定了基础。
- 郝文艳陈培芳代小丽王萍吴大平石德顺李湘萍
- 关键词：水牛乳腺组织
