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禽白血病病毒抗体间接ELISA检测方法的建立与应用: 2025年; 为了建立一种禽白血病病毒(ALV)抗体检测方法,利用原核表达禽白血病病毒的p27蛋白建立一种检测ALV抗体的间接ELISA方法。结果显示,p27蛋白以包涵体形式表达,Western blot检测显示p27蛋白具有良好的反应活性,以p27蛋白为包被抗原建立的间接ELISA方法检测NDV、IBDV、IBV、AIV-H9、ILTV阳性血清均为阴性,最低抗体检出效价为1︰12800,与进口试剂盒的符合率为94.87%,检测临床血清样品的阳性率为14.02%。结果说明该研究建立的间接ELISA方法特异性强、敏感性高、符合性好,可为ALV的检测和净化等提供一种简单快速的方法。; 苏晓月吕转平沈亚安赵明明唐思静; 关键词：禽白血病病毒间接ELISA方法抗体检测

肠炎沙门菌fliC基因的原核表达及其间接ELISA方法的建立: 2025年; 建立一种基于肠炎沙门菌鞭毛蛋白FliC的间接ELISA方法。在大肠杆菌BL21(DE3)中表达肠炎沙门菌FliC截短蛋白,将其作为包被抗原建立间接ELISA方法;采用52份临床阴性鸡血清测定该方法的阴阳性阈值,采用沙门菌阳性鸡血清测定该方法的特异性、敏感性和重复性,采用135份临床血清样品测定该方法与BioChek公司禽沙门菌D群ELISA试剂盒检测结果的符合性和临床适用性。结果显示:截短表达的FliC蛋白在BL21(DE3)中呈可溶性表达,可与H:g抗体特异性结合,与H:i和H:m抗体不反应;基于截短表达的FliC蛋白的间接ELISA方法包被抗原最优质量浓度为4 ng/μL、待检血清最优稀释度为1∶40、HRP标记的第二抗体的最优稀释度为1∶2000;该方法的阴性阈值为0.82,阳性阈值为0.94,可检出80倍稀释的肠炎沙门菌阳性血清抗体,未检出鸡白痢沙门菌、鼠伤寒沙门菌、姆班达卡沙门菌、汤姆森沙门菌和肯塔基沙门菌阳性血清抗体,批间和批内重复检测变异系数分别为0.43%~5.13%和0.50%~2.68%,与禽沙门菌D群ELISA试剂盒的检测符合率为94.1%。本研究通过原核表达获得FliC截短蛋白,并基于该蛋白成功建立了一种检测肠炎沙门菌抗体的间接ELISA检测方法。; 赵东旭蔡梦雷苏士炫刘逸洋闫雪敏张政钢薛晓阳闫金坤崔国林; 关键词：肠炎沙门菌 FLIC 原核表达间接ELISA

非洲猪瘟病毒pK205R蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立: 2025年; 旨在建立可以检测非洲猪瘟病毒(ASFV)非结构蛋白pK205R抗体的血清学检测方法。基于杆状病毒表达系统构建重组杆粒BacmidpK205R,以纯化的pK205R蛋白为包被抗原,优化各项反应条件,建立间接ELISA抗体检测方法,验证方法的特异性、灵敏性、重复性,并对临床血清样品进行检测。结果显示:pK205R蛋白可以与ASFV阳性血清发生发应,ELISA方法的抗原包被浓度为50 ng/孔,4℃过夜包被,封闭液为2%牛血清白蛋白(BSA),37℃封闭1 h,待检血清以5%脱脂乳进行1∶200稀释,37℃孵育0.5 h;二抗工作浓度为1∶5000,37℃孵育0.5 h,37℃下显色10 min;该方法的阳性临界值为0.186(≥0.186为阳性,<0.186为阴性),且具有良好的特异性、灵敏性、可重复性,与商品化试剂盒符合率为79.92%。本研究成功建立pK205R非洲猪瘟间接ELISA抗体检测方法,为进一步优化和研制非洲猪瘟抗体的快速检测试剂盒提供了参考。; 王燕邹艳丽何佳依刘珊苗雨润任炜杰王振忠白昀陈欢钱莺娟贾红吴晓东冯志新郑龙三; 关键词：非洲猪瘟病毒间接ELISA 杆状病毒表达

基于Stefin抗原兔豆状囊尾蚴病间接ELISA检测方法的建立: 2025年; 【目的】研究半胱氨酸蛋白酶抑制剂Stefin的生物活性,建立豆状囊尾蚴病新的、高效便捷的血清学诊断方法。【方法】用Bradford法测定纯化后的重组蛋白浓度。以重组蛋白stefin作为包被抗原,建立间接ELISA诊断方法,通过从抗原包被浓度、包被条件、封闭条件、血清稀释度、酶标二抗稀释度、反应时间、温度等条件,以阳性血清与阴性血清的D_(450 nm)比值(P/N)作为判断标准优化反应条件,并对ELISA方法的敏感性、特异性、重复性进行检测。【结果】测定了重组蛋白浓度。间接ELISA检测方法临界值为0.352。阳性血清稀释倍数至1∶12800时,D_(450 nm)的值仍大于临界值。兔球虫、兔弓形虫等阳性血清检测显示D_(450 nm)均小于0.352。【结论】Stefin蛋白可以大批量获得,以stefin作为抗原建立的间接ELISA检测方法可以应用于豆状囊尾蚴病的诊断和流行病学调查研究,对豆状囊尾蚴病的有效防控具有重要的意义。; 王由森石正发车亮张月玥羊倩倩李甲肖琴孙晓林王泽祥; 关键词：豆状囊尾蚴 BRADFORD 间接ELISA

基于真核表达塞内卡病毒A VP2蛋白的间接ELISA检测方法: 2025年; 为建立检测塞内卡病毒A(SVA)抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA),本试验利用昆虫杆状病毒表达系统表达SVA的主要结构蛋白和保护性抗原VP2,通过间接免疫荧光试验(IFA)验证VP2的免疫反应性,并使用氨基三乙酸镍(NiNTA)树脂亲和纯化重组VP2蛋白。以纯化的VP2蛋白为包被抗原,利用棋盘滴定法确定最优的抗原包被浓度和待检血清稀释度,通过优化反应条件和确定临界值,建立了检测SVA抗体的间接ELISA检测方法,并评估了其特异性、敏感性、重复性及与IFA的检测符合率。结果显示,重组VP2蛋白在杆状病毒感染的Sf9细胞内呈现可溶性表达,能够被SVA VP2特异性单克隆抗体2F5识别;经Ni-NTA纯化后,获得了分子量约31 kDa的重组VP2蛋白;间接ELISA的最佳抗原包被浓度为2μg/mL,最佳血清稀释度为1∶100,最佳酶标二抗稀释度为1∶10000;阴阳性临界值为0.287;与口蹄疫病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪丁型冠状病毒、伪狂犬病毒和猪圆环病毒2型抗血清无交叉反应;批内与批间变异系数均低于10%。利用建立的间接ELISA检测了实验室保存的52份猪血清样本,与IFA的检测符合率为96.15%(50/52)。综上,本试验间接ELISA的成功建立为SVA抗体检测和流行病学调查提供了有力工具。; 裴宗飞于凯蓝安欣娜陈俊雯张永宁; 关键词：VP2蛋白昆虫杆状病毒表达系统间接ELISA

猪副流感病毒5型HN蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立: 2025年; 为建立5型猪副流感病毒(Porcine parainfluenza virus 5,PPIV5)的血清学检测方法,用原核表达系统对PPIV5 HN蛋白进行重组表达,并用该重组蛋白进行PPIV5 ELISA检测方法的建立。结果显示,重组HN蛋白大小约为60 ku,反应性良好,以200 ng/孔包被抗原,10%BSA封闭30 min,1∶400稀释待检血清,1∶10000稀释二抗孵育30 min,显色5 min为最佳反应条件,该方法与猪圆环病毒、猪流行性腹泻病毒等阳性血清均无交叉反应,特异性好,PPIV5阳性血清最低检测稀释度为1∶800,敏感性高,批内和批间的变异系数均小于5%,重复性好。表明建立的ELISA方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,为PPIV5的血清学诊断奠定了基础。; 倪民婷张耕馨孙普刘光亮陈佳宁王金涛; 关键词：HN蛋白原核表达间接ELISA

猫杯状病毒VP1蛋白原核表达及间接ELISA检测方法的建立: 2025年; 旨在建立一种灵敏、准确、高通量检测猫杯状病毒(feline calicivirus, FCV)抗体的间接ELISA方法。本研究通过优化表达条件,在大肠杆菌中表达FCV的VP1蛋白,对重组蛋白进行镍离子亲和层析纯化和透析复性,通过SDS-PAGE和Western blot验证重组蛋白;以重组VP1蛋白为包被抗原建立检测FCV抗体的间接ELISA方法,通过方阵滴定法确定抗原最佳包被浓度和抗体最佳稀释度,优化抗原包被条件、样品孵育时间、封闭液种类等条件,并对其性能进行验证。结果:表达的目的蛋白条带清晰、大小正确,与FCV阳性血清具有良好的反应性,建立的间接ELISA方法检测6份FCV阴性血清,猫细小病毒(feline parvovirus, FPV)阳性血清,猫疱疹病毒(feline herpesvirus, FHV)阳性血清均为阴性,对FCV阳性血清的最低检出效价可达1∶10 240,组间与组内变异系数均小于10%,与商品化试剂盒相比符合率达100%。综上,本研究建立的间接ELISA方法具有良好的灵敏度、重复性和符合率,与其他猫常见病毒阳性血清不发生交叉反应,可以用于临床样品的检测,为FCV感染的诊断、防控、疫苗免疫效力评价提供了技术手段。; 姬晶晶王彬何昭群李嘉豪单衍可刘斐; 关键词：原核表达间接ELISA

猪轮状病毒VP6蛋白截短表达及间接ELISA抗体检测方法的建立: 2025年; 【目的】通过构建猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)VP6截短蛋白(第177—382位氨基酸)的原核表达系统,建立检测PoRV抗体的间接ELISA方法,为PoRV血清学监测提供检测手段。【方法】设计1对针对截短VP 6基因的特异性引物,以pMD19-T-VP6重组质粒为模板扩增VP 6截短基因。利用pET-32a(+)原核表达载体构建pET32a-PoRV-VP6重组质粒。以大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞为宿主菌,对重组质粒进行诱导表达,并优化表达条件。利用His标签镍柱对pET32a-PoRV-VP6重组蛋白进行纯化,以此作为包被抗原,通过单一变量法优化抗原包被浓度、血清稀释度、二抗稀释度及一抗、二抗孵育时间等工作条件。确定间接ELISA方法的阴阳性临界值,检验其特异性、敏感性、重复性及符合性,并对2021—2024年采自贵州地区不同猪场的384份临床猪血清进行检测。【结果】试验成功构建pET32a-PoRV-VP6重组表达载体,实现VP6蛋白的原核截短表达,蛋白分子质量大小约40 ku,具有良好的反应原性。对间接ELISA方法条件进行优化,确定VP6包被抗原最佳浓度为2μg/mL、阳性血清稀释度为1∶100、血清样品和二抗孵育时间均为60 min、TMB反应时间为10 min、阴阳性临界值(D 450 nm)为0.410。建立的间接ELISA方法与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪冠状病毒(PDCoV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等病毒标准阳性血清不发生反应,特异性强;批内和批间重复试验变异系数均<10%,重复性好;与PoRV A型ELISA抗体检测试剂盒的总体符合率为96.80%。间接ELISA方法检测临床384份猪血清样品结果显示,样品总阳性率为28.91%。【结论】本研究成功实现了PoRV VP6蛋白的截短表达,并建立了PoRV间接ELISA抗体检测方法,适用于临床PoRV抗体检测和疫苗免疫效果评价。; 潘向英曾智勇梁海英汤德元王彬叶泥田红利边孟婷柳佳佳黄书; 关键词：截短表达间接ELISA

猪捷申病毒5型VP1蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立: 2025年; 旨在建立针对猪捷申病毒(porcine teschovirus,PTV)5型的间接ELISA检测方法,为其防控提供物质储备。PTV是猪的一种急性、烈性病原,以高发病率和高致死率为主要特征。其临床表现包括脑炎、肺炎、繁殖障碍、心肌炎及腹泻等多种症状。但该病原亚型众多,不同亚型间临床表现差异较大,且缺乏高效、特异的血清学检测方法,阻碍了对PTV-5的防治。本研究针对危害较大的PTV-5构建了pET-30a-VP1重组质粒,通过原核表达获得了VP1蛋白,以纯化的VP1为包被抗原,经条件优化成功建立了针对PTV-5的间接ELISA方法。该方法与常见猪源病毒标准阳性血清无交叉反应,最低检测稀释度为1∶3200,批内与批间变异系数均低于10%,具有良好的特异性、敏感性和重复性。利用该方法对东北地区279份临床样本进行检测,其阳性率为67.74%,与报道的流行情况相符。本研究建立的间接ELISA检测方法综合评价良好,为PTV-5的临床检测提供技术支持。; 邵永恒倪民婷高梦玲汤娇张耕馨林圣宇刘光亮陈佳宁王雯慧; 关键词：猪捷申病毒 VP1蛋白原核表达间接ELISA

猪急性腹泻综合征冠状病毒N蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立及初步应用: 2025年; 为建立一种猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)血清抗体的快速检测方法,本研究首先经PCR扩增SADS-CoV N基因,纯化鉴定后克隆至表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32a-N。重组N蛋白诱导表达并通过SDS-PAGE和Western blot鉴定后,采用纯化的重组N蛋白作为包被抗原,以兔抗猪HRP-IgG作为二抗,利用方阵滴定法优化各反应条件,建立了一种以SADS-CoV N蛋白为靶标的检测SADS-CoV血清抗体的间接ELISA方法,并对此方法的敏感性、特异性、重复性及临床应用价值进行鉴定。SDS-PAGE及Western blot结果显示,重组表达的N蛋白约为70 ku,且具有良好的反应原性。采用该方法检测SADS-CoV阳性血清抗体效价可达1∶3 200,并且与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪丁型冠状病毒(PDCoV)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪轮状病毒(PoRV)和猪圆环病毒(PCV)阳性血清均无交叉反应,具有良好的敏感性和特异性。批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%,具有较好的重复性。利用该方法和间接免疫荧光方法(IFA)分别对50份猪临床血清样品进行检测,结果显示二者的总符合率为98%。综上,本研究建立了一种基于SADS-CoV N蛋白的间接ELISA抗体检测方法,可用于临床SADS-CoV血清抗体检测以及流行病学的监测,对防控SADS-CoV的流行具有重要意义。; 曾苗苗杨小曼张鑫刘大凯时洪艳张记宇张燎原陈建飞冯廷帅李修文石达冯力; 关键词：N蛋白间接ELISA

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