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牛源IFI6基因的克隆及其蛋白生物信息学分析与真核表达载体构建: 2025年; 为构建牛源IFI6基因真核表达载体,试验采用RT-PCR方法扩增牛肾细胞(MDBK)的IFI6基因,对其蛋白的理化性质、蛋白亲/疏水性、信号肽、跨膜结构域、二/三级结构进行预测分析,并构建牛源IFI6基因真核表达载体pEGFP-N1-IFI6。结果:牛源IFI6基因开放读码框序列长度为405 bp,编码134个氨基酸,蛋白分子质量为32425.61 u,等电点为5.20,不稳定系数为57.75(>40),属于不稳定疏水性蛋白质,存在信号肽和跨膜结构域;Eco RⅠ、Bam HⅠ双酶切的pEGFP-N1-IFI6重组质粒扩增出4700、405 bp条带,分别与pEGFP-N1、IFI6基因相符。结论:pEGFP-N1-IFI6真核表达载体构建成功,可为家畜的抗病毒研究奠定基础。; 肖芳嵇辛勤; 关键词：生物信息学分析表达载体构建

马山黑山羊MAPK8基因克隆、生物信息学分析及真核表达载体构建: 2025年; [目的]克隆马山黑山羊丝裂原活化蛋白激酶8(mitogen-activated protein kinase 8,MAPK8)基因序列,并对该基因进行生物信息学分析,构建其真核表达载体,为山羊乳腺发育及MAPK8基因在转分化过程中的研究提供试验材料。[方法]参考山羊MAPK8基因序列(GenBank登录号:XM_018042429.1)设计引物,利用PCR扩增马山黑山羊MAPK8基因CDS序列并克隆;分别使用DNAStar和Mega 11.0软件进行序列比对及系统进化树构建,并利用ProtParam、ProtScale等软件进行生物信息学分析;构建真核表达载体并进行慢病毒包装后收集病毒液上清,感染马山黑山羊成纤维细胞,并通过实时荧光定量PCR检测感染病毒组和对照组MAPK8基因表达水平。[结果]马山黑山羊MAPK8基因CDS区全长1 155 bp,编码384个氨基酸,蛋白分子质量为43.98 ku,分子式为C_(1968)H_(3114)N_(528)O_(569)S_(22),等电点(pI)为7.13。相似性比对结果显示,马山黑山羊与不同物种间MAPK8基因氨基酸序列相似性均高于85%,表明MAPK8氨基酸序列较为保守。系统进化树显示,马山黑山羊MAPK8基因氨基酸序列与牛的亲缘关系最近,与斑马鱼的亲缘关系最远。马山黑山羊MAPK8蛋白为亲水性,不属于跨膜蛋白,主要分布在细胞质(52.2%)、线粒体(26.1%)、细胞核(17.4%)和细胞膜(4.3%)中,含有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化结构域(第26―321位氨基酸处)。MAPK8蛋白二级结构包括无规则卷曲、α-螺旋、β-转角和延伸链。互作蛋白预测显示,MAPK8蛋白可能与MAPK9、JUN、TP53、FOS、JUNB、MAP2K4、MAP2K7、MAPK8IP1和NFATC3蛋白存在互作。试验成功构建MAPK8基因慢病毒真核表达载体pCDH-CMV-MAPK8-mchery-Puro,转染马山黑山羊成纤维细胞后产生红色荧光信号,试验组细胞内MAPK8基因表达量极显著高于对照组(P<0.01)。[结论]本研究成功克隆了马山黑山羊MAPK8基因CDS序列,并构建了pCDH-CMV-MAPK8-mchery-Puro真核表达载体,为山羊MAPK8基因功能及应用�; 雷志刚潘宏张丹丹刘权辉孙哲邓珊黄奔; 关键词：生物信息学真核表达

马铃薯StCHS4和StCHS5表达载体构建及功能分析: 2025年; 查尔酮合酶(CHS)是调控植物类黄酮通路早期生物合成的重要结构基因,在植物生长发育和逆境响应中发挥作用。前期通过表达量分析,在马铃薯CHS家族中筛选到花青素生物合成关键基因StCHS4和StCHS5。为进一步探究马铃薯StCHS4和StCHS5在类黄酮和花青素生物合成中的功能,首先利用在线网站分析StCHS4和StCHS5蛋白结构,之后以pRI101双元表达载体为基础,通过同源重组法构建35S∷StCHS4-GFP和35S∷StCHS5-GFP植物过表达载体,并将重组载体转化至农杆菌GV3101菌株中。利用本氏烟草进行瞬时转化,明确StCHS4和StCHS5蛋白亚细胞定位情况。以红花烟草为试验材料,分别进行瞬时超表达和稳定遗传转化,分析StCHS4和StCHS5基因过表达后总类黄酮和总花青素的含量变化。结果表明:StCHS4和StCHS5蛋白二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,StCHS4为不稳定的亲水蛋白,StCHS5为稳定的亲水蛋白。StCHS4和StCHS5分别与辣椒CHS和番茄CHS1亲缘关系较近。亚细胞定位结果显示,StCHS4和StCHS5蛋白均在细胞质和细胞膜中表达。烟草瞬时超表达中,StCHS4和StCHS5基因在注射3~5 d显著促进花青素累积。分别获得3个阳性烟草转基因株系,与野生型相比,转基因植株中StCHS4和StCHS5显著高表达,总类黄酮和总花青素含量均高于野生型。StCHS4-OE3和StCHS5-OE1转基因植株中的总类黄酮含量显著提升,StCHS5-OE1和StCHS5-OE2中花青素含量分别提高89%,131%。上述结果表明,StCHS4和StCHS5是马铃薯类黄酮通路中关键CHS基因,过表达可促进花青素与类黄酮生物合成。; 王童童王文静董欣宇宋家凤盛苏奥程洁蓝郑婷婷吕钊彦朱晓彪侯华兰; 关键词：马铃薯类黄酮花青素亚细胞定位功能分析

桃PpCLH1基因过表达载体构建与功能鉴定: 2025年; 【目的】探究PpCLH1基因在叶绿素降解中的功能。果皮叶绿素降解是桃果实成熟过程中的标志性信号之一。叶绿素酶(Chlorophyllase,CLH)一直被人们认为是叶绿素降解过程中的第一种酶,CLH是参与植物叶片和果实褪绿的重要基因。然而,桃CLH基因在果皮叶绿素降解中的功能尚不清晰。【方法】以中蟠102为试验材料,克隆PpCLH1基因,分析PpCLH1的氨基酸序列,检测桃果实成熟过程中果皮PpCLH1的转录水平,研究PpCLH1基因在桃叶绿素降解过程中的功能。【结果】PpCLH1编码区全长为972 bp,编码323个氨基酸,在蔷薇科植物中表现出高度的保守性。PpCLH1基因的表达水平随着果实成熟褪绿呈现逐渐上升的趋势,在成熟前12 d达到最高,之后表达量不断降低。瞬时过表达PpCLH1基因后,烟草叶片颜色出现明显褪绿。PpCLH1是桃果皮转色期叶绿素降解的关键基因。【结论】通过对PpCLH1基因进行鉴定和功能研究,发现果实成熟前12 d PpCLH1明显高表达,在烟草叶片中瞬时过表达PpCLH1会导致叶片明显褪绿,这为进一步解析桃果实发育过程中叶绿素降解的分子机制提供了参考。; 刘鑫张晓煜孟君仁李昂段文宜孙世航潘磊曾文芳王志强牛良; 关键词：叶绿素酶

水牛SFRP 1基因序列分析、真核表达载体构建及组织表达分析: 2024年; 【目的】获取水牛分泌型卷曲相关蛋白1(SFRP1)基因CDS区序列,并预测其编码蛋白的结构功能,构建SFRP 1基因真核表达载体,检测SFRP 1基因在水牛不同组织中的表达情况,为探索SFRP 1基因在水牛生长发育中的作用奠定基础。【方法】以水牛卵巢组织cDNA为模板,通过RT-PCR对SFRP 1基因CDS区序列进行扩增并测序,利用生物信息学在线分析软件对水牛SFRP 1基因与不同物种进行比对和系统进化树构建,并预测SFRP1蛋白理化性质、信号肽、跨膜结构等。将获得的目的基因连接至pCMV-HAhyPBase-mcheery载体并转染至水牛颗粒细胞,检测转染后荧光和基因表达情况。通过实时荧光定量PCR检测水牛不同组织中SFRP 1基因表达情况。【结果】水牛SFRP 1基因CDS区长927 bp,共编码308个氨基酸。多重序列比对结果显示,水牛SFRP 1基因氨基酸序列与黄牛、牦牛、山羊、虎鲸、黑猩猩、北极狐、猫、人、小鼠的相似性分别为100%、100%、99.65%、98.58%、98.23%、98.23%、98.58%、98.23%、96.45%,存在CRD_FZ、NTR_like和DUF3367结构域。水牛SFRP 1基因核苷酸序列与黄牛、绵羊、山羊、牦牛、野牛、马鹿、野骆驼、猪、人的相似性分别为97.3%、95.9%、95.8%、94.5%、94.2%、93.7%、80.4%、78.5%和77.3%。系统进化树结果显示,水牛与黄牛、牦牛、野牛聚为一支。生物信息学分析结果显示,SFRP1蛋白呈碱性,为不稳定蛋白;第1—15位氨基酸处存在信号肽,为分泌型蛋白,存在跨膜结构,主要定位于细胞外;存在21个磷酸化位点和8个O-糖基化修饰位点。二级结构主要由α-螺旋、延伸链和无规则卷曲构成;水牛、黄牛、人的SFRP1蛋白三级结构高度相似。成功构建pCMV-mcheery-SFRP1真核表达载体并转染水牛颗粒细胞,转染72 h后pCMV-mcheery-SFRP1重组质粒组细胞内SFRP 1基因表达量极显著高于对照组(P<0.01)。实时荧光定量PCR结果显示,SFRP 1基因在水牛不同组织中�; 黄丽清段安琴郑海英杨春艳尚江华; 关键词：水牛真核表达载体

猪源hnRNPA1基因克隆及其真核表达载体构建: 2024年; 【目的】克隆猪源异质性核糖核蛋白A1(hnRNPA1)基因编码区(CDS)序列并构建其真核表达载体,为探究猪源hnRNPA1蛋白结构及其生物学特性提供理论参考。【方法】利用总RNA提取试剂盒提取PK-15细胞总RNA并反转录合成cDNA,以此为模板,采用SnapeGene设计hnRNPA1基因特异性扩增引物,PCR扩增获得hnRNPA1基因CDS序列。通过ProtParam、ExPASy-ProtScale、TMHMM-1.0、SignalP-6.0、SPOMA、SWISS-MODEL和NetPhos 3.1等预测hnRNPA1蛋白的理化性质、结构及磷酸化位点。构建pcDNA3.0-hnRNPA1-Flag真核表达载体并转染HEK-293T细胞,通过实时荧光定量PCR、Western blottiing和免疫荧光染色试验检测hnRNPA1基因真核表达载体构建情况、hnRNPA1蛋白在细胞中的表达及分布情况。【结果】成功克隆猪源hnRNPA1基因CDS序列。生物信息学分析结果显示,hnRNPA1基因CDS序列全长963 bp,编码320个氨基酸残基,hnRNPA1蛋白分子量约为35 kD,理论等电点(pI)为9.27,脂肪系数为38.34,不稳定系数为43.87(大于40.00),蛋白结构相对不稳定,总平均亲水性指数(GRAVY)为-0.879,属于亲水性蛋白,不含跨膜结构域和信号肽,二级结构由α-螺旋(16.56%)、无规则卷曲(72.50%)和延伸链(10.94%)组成,存在48个潜在的磷酸化位点。Western blotting检测结果显示,真核表达载体pcDNA3.0-hnRNPA1-Flag转染HEK-293T细胞后能成功表达hnRNPA1蛋白。免疫荧光染色结果显示,hnRNPA1蛋白主要在胞质中表达。【结论】成功克隆猪源hnRNPA1基因CDS序列。猪源hnRNPA1蛋白为不稳定的亲水性蛋白,不含跨膜结构域和信号肽,二级结构主要为无规则卷曲。成功构建pcDNA3.0-hnRNPA1-Flag真核表达载体,hnRNPA1蛋白主要在胞质中表达。; 王文锋王文锋金奕欣张丽媛宋丹丹张丽媛宋丹丹; 关键词：生物信息学分析表达载体构建

鼠源ATP5B基因克隆及其原核和真核表达载体构建: 2024年; 【目的】克隆鼠源ATP5B基因,构建其原核和真核表达载体,为研究ATP5B蛋白功能及其在病毒感染过程中的作用机制提供基础。【方法】克隆鼠源ATP5B基因编码区(CDS),运用ProtParam、ProtScale和SignalP-5.0等对ATP5B蛋白进行生物信息学分析。采用同源重组方法构建原核表达载体pGEX-4T-1-ATP5B-Flag和真核表达载体pcDNA3.0-ATP5B-Flag。以原核表达载体pGEX-4T-1-ATP5B-Flag转化大肠杆菌BL21感受态细胞,利用IPTG进行诱导表达,分析最适诱导温度和IPTG浓度。以真核表达载体pcDNA3.0-ATP5B-Flag转染HEK-293T细胞,通过Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)检测ATP5B蛋白在细胞中的表达及分布情况。【结果】鼠源ATP5B基因CDS长1590 bp,鼠源ATP5B蛋白由529个氨基酸残基构成,分子量为55 kD,理论等电点(pI)为5.21,属于稳定的疏水性蛋白,无跨膜结构域和信号肽,不属于分泌蛋白;鼠源ATP5B蛋白二级结构中α-螺旋占43.67%,无规则卷曲占32.51%,β-转角占9.45%,延伸链占14.37%。原核表达载体pGEX-4T-1-ATP5B-Flag经IPTG诱导后,通过考马斯亮蓝染色和Western blotting在81 kD处成功检测到融合蛋白,且主要以包涵体形式表达,诱导条件以30℃、0.5 mmol/L IPTG的效果更好。以真核表达载体pcDNA3.0-ATP5B-Flag转染HEK-293T细胞后,在55 kD处检测到Flag标签特异性条带,即ATP5B蛋白在HEK-293T细胞中成功表达,IFA检测结果表明该蛋白主要定位在细胞质中。【结论】成功构建鼠源ATP5B基因原核和真核表达载体,原核表达载体表达出的融合蛋白主要以包涵体形式存在,只有少量可溶蛋白,真核表达的ATP5B蛋白主要定位在细胞质中。鼠源ATP5B蛋白是理化性质稳定的疏水性蛋白,无信号肽位点,不属于分泌蛋白。; 段辰星黄袁慧闵开骏李晓宁罗廷荣; 关键词：基因克隆生物信息学分析表达载体构建

新西兰白兔BMP 15基因的真核表达载体构建、表达模式及其在卵巢组织的表达: 2024年; 旨在获得新西兰白兔BMP 15基因序列及其组织表达规律,构建其真核表达载体,预测BMP15的生物学功能。本研究选择180日龄性成熟的健康新西兰白兔作为研究对象,采用RT-PCR技术扩增BMP 15基因CDS区序列,利用T4连接方法将目的片段连接至线性化的Pmcherry-N1和pCMV-Myc空载体,构建真核表达载体,利用生物信息学分析其编码蛋白的性质及结构。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术与Western blotting技术检测pCMV-Myc-BMP 15过表达情况。接下来,使用qRT-PCR检测BMP 15基因在不同组织中的表达水平。激光共聚焦方法检测BMP 15基因的亚细胞定位。利用免疫荧光技术检测内源BMP15在新西兰白兔卵巢组织定位情况。结果表明:克隆得到新西兰白兔BMP 15基因CDS区序列长1182 bp,PCR及测序结果表明pCMV-Myc-BMP 15和Pmcherry-N1-BMP 15真核表达载体构建成功。生物信息学分析显示,BMP 15基因编码393个氨基酸;BMP15蛋白不稳定系数为55.32,等电点大小为9.69,是一种稳定的碱性蛋白质。BMP15蛋白共有26个磷酸化位点,15个糖基化位点,存在信号肽,不存在跨膜结构域。系统进化树表明,新西兰白兔与猪亲缘关系最近,与鸡的亲缘关系最远。二级结构和三级结构分析结果表明,BMP15蛋白主要由α-螺旋(38.68%)、无规则卷曲(37.4%)、延伸链(15.52%)、β-转角(8.40%)组成,为混合型蛋白。蛋白互作关系预测发现,BMP15蛋白与FSHR、FIGLA、BMPR1B、AMHR2、NOBOX等卵巢生长发育的相关蛋白之间存在相互作用。不同组织表达分析显示,BMP 15基因在卵巢组织中特异性表达;激光共聚焦结果显示,BMP15主要存在于在细胞质中。将pCMV-Myc-BMP 15转染至HEK293T细胞内,BMP15的mRNA水平和蛋白水平均显著上调。卵巢组织免疫荧光检测结果显示,BMP15主要定位在卵巢颗粒细胞的细胞质中。本研究成功构建了BMP15的真核表达载体,对BMP 15基因及其编码的蛋白的理化性质和生物�; 陈孟娟刘雨晴王智通温佳乐许会芬于光晴李明; 关键词：新西兰白兔细胞定位

一种蓝光光控阻遏蛋白LOV-cI表达载体构建方法与应用: 本发明涉及一种蓝光光控阻遏蛋白LOV‑cI融合表达元件调控pR光启动子的表达载体构建方法与应用。本发明提供一种LOV‑cⅠ表达载体的构建方法，将目的基因与cI阻遏蛋白基因和LOV结构域融合，构建基因表达盒；再将基因表达盒...; 张擎王家胜刘孟岩李飞何越陈俊汝

绵羊GSTA2基因克隆、生物信息学分析及真核表达载体构建被引量：1: 2024年; 为阐明绵羊谷胱甘肽S转移酶α2(Glutathione S-transferase alpha 2,GSTA2)基因功能,利用牛GSTA2基因序列设计引物,提取绵羊皮肤组织总RNA,应用RT-PCR、基因克隆、生物信息学对GSTA2基因进行研究,构建真核表达载体,转染绵羊皮肤成纤维细胞,应用qPCR技术检测GSTA2基因的表达。结果表明,克隆到绵羊GSTA2基因672 bp编码区序列(GenBank登录号:OR440604.1),编码223个氨基酸,分子量为25.39 ku。氨基酸比对和系统进化树分析表明,绵羊与牛的GSTA2相似度最高,达87.39%。GSTA2的二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。构建的真核表达载体pcDNA3.1-GSTA2转染绵羊皮肤成纤维细胞后,GSTA2基因表达量极显著上调(P <0.001)。说明成功克隆了绵羊新基因GSTA2的CDS序列,并成功构建了其真核表达载体。; 邱丽霞林秀曹忻杨华杨永林余乾张文喆; 关键词：绵羊生物信息学真核表达载体

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