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新型融合蛋白——蛋白转导结构域4‑超氧化物歧化酶1减轻大鼠心肌缺血/再灌注损伤的实验研究被引量：1: 2021年; 目的研究新型融合蛋白——蛋白转导结构域(protein transduction domain,PTD)4超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)1对心肌缺血/再灌注损伤(myocardial ischemia/reperfusion injury,MI/RI)大鼠肌酸激酶(creatine kinase,CK)、乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)及丙二醛(malondialdehyde,MDA)的影响,探讨PTD4SOD1对再灌注心肌的保护作用。方法40只SPF级雄性SD大鼠,体重(330±20)g,按随机数字表法分为4组:假手术组(S组)、MI/RI组、SOD1蛋白组(SOD1组)、PTD4SOD1融合蛋白组(PTD4SOD1组),每组10只。S组只穿线不结扎左冠状动脉前降支(left anterior descending,LAD),其余3组均通过结扎与松解LAD的方法制备大鼠MI/RI模型,缺血30 min,再灌注120 min。S组、MI/RI组在再灌注的同时通过尾静脉分别注射0.9%氯化钠注射液(1 ml),SOD1组在再灌注的同时通过尾静脉注射SOD1蛋白500μg(1 ml),PTD4SOD1组在再灌注的同时通过尾静脉注射PTD4SOD1500μg(1 ml)。再灌注结束时通过左心室采血5 ml,后快速摘取心脏。分别使用免疫荧光检测PTD4SOD1在大鼠MI/RI模型中的穿膜能力,比色法检测CK、LDH的含量,硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)染色法检测MDA的含量。结果免疫荧光结果显示,S组、MI/RI组、SOD1组均没有代表融合蛋白的荧光出现,PTD4SOD1组出现荧光。与S组比较,其余3组CK、LDH和MDA含量均明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);MI/RI组CK、LDH、MDA含量与SOD1组差异无统计学意义(P>0.05),PTD4SOD1组CK、LDH、MDA含量较MI/RI组和SOD1组明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论PTD4与SOD1重组后表达纯化的PTD4SOD1能显著降低血清CK、LDH和MDA值,抑制脂质过氧化反应,实现了对心肌细胞的保护作用。; 陈靖宜龚小芳李清刘菊英; 关键词：蛋白转导结构域融合蛋白心肌肌酸激酶乳酸脱氢酶

蛋白转导结构域4-铜/锌-超氧化物歧化酶融合蛋白的制备及其穿细胞膜的功能研究: 2018年; 目的拟构建蛋白转导结构域(PTD)4-铜/锌-超氧化物歧化酶(Cu/ZnSOD)原核表达质粒,纯化制备PTD4-Cu/ZnSOD融合蛋白,探讨其穿膜能力。方法设计合成hCu/ZnSOD引物,扩增hCu/ZnSOD cDNA片段;采用PCR靶向克隆法将扩增产物与含有相同酶切位点载体质粒PET16b-PTD4进行重组,扩增质粒,双酶切鉴定和DNA测序;获得PET16b-PTD4-Cu/ZnSOD(CDs)原核表达载体,导入感受态E.coli BL21(DE3)中,进行扩增培养,收集菌体,将其裂解离心、Ni_2^+亲和层析、收集目的蛋白。融合蛋白孵育人心肌细胞,免疫荧光法检测融合蛋白穿膜能力。结果通过测序证实实验扩增所得的PTD序列与设计的预期序列一致。设计并简并PTD4-Cu/ZnSOD基因长度为567 bp,通过引物进行正反向测序证实该序列与已被登录的GENBANK中Cu/ZnSOD序列相一致,并构建了相应的原核表达质粒。并在E.coli BL21进行大量表达,最终收集的PTD4-Cu/ZnSOD具有良好水溶性。SDS-page分析显示构建的PTD4-Cu/ZnSOD分子量约为20 kDa,与预期的蛋白分子量20.45 kDa相符合。融合蛋白可以穿透心肌细胞胞膜,进入细胞后主要分布在胞质和胞核内并具有天然活性。结论成功地构建了PET16bPTD4-Cu/ZnSOD原核表达质粒,获得了可穿透心肌细胞膜的PTD4-Cu/ZnSOD融合蛋白,为应用Cu/ZnSOD治疗缺血性疾病的研究奠定了基础。; 王宇刘菊英王贤裕柯昌斌李瑞明王晓勋; 关键词：蛋白转导结构域心肌细胞

蛋白转导结构域修饰小鼠干扰素-γ的研制: 2010年; 目的:制备蛋白转导结构域修饰小鼠干扰素-γ(PTD-mIFN-γ),为研究PTD-mIFN-γ功能作准备。方法:以质粒pUC19/mIFN-γ为模板,经3轮聚合酶链反应(PCR)扩增编码PTD-mIFN-γ片段,克隆于质粒pUC19上,测序鉴定正确后构建到pQE80L表达质粒载体中,经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定,利用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blot法检测表达的目的蛋白,镍离子-次氨基三乙酸(Ni2+-NTA)凝胶亲和层析纯化重组蛋白,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测PTD-mIFN-γ。结果:PCR扩增得到编码PTD-mIFN-γ的cDNA,SDS-PAGE和Western blot法分析显示重组蛋白获得了高效表达,ELISA法检测出目的蛋白。结论:成功制备了PTD-mIFN-γ。; 胡大强; 关键词：蛋白转导结构域干扰素-Γ 蛋白纯化酶联免疫吸附实验

重组蛋白转导结构域-SARA融合蛋白生物学功能的初步研究被引量：1: 2010年; 目的初步研究重组蛋白转导结构域(Protein transduction domain,PTD)-SARA融合蛋白(PTD-SARA)抗肾脏纤维化的生物学功能。方法采用免疫细胞化学法检测重组PTD-SARA融合蛋白的穿膜作用;通过显微镜观察人肾小管上皮细胞HK2形态学变化,Western blot法测定上皮细胞钙黏蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和磷酸化Smad3蛋白水平,以比较PTD-SARA融合蛋白和SARA蛋白抑制转化生长因子-β1(TGF-β1)诱发的肾小管上皮细胞向间质细胞转分化作用。结果重组PTD-SARA融合蛋白可高效地转入细胞胞质与胞核;PTD-SARA融合蛋白与SARA蛋白相比,能更显著地上调E-cadherin蛋白的表达,下调α-SMA和磷酸化Smad3蛋白的表达,且差异有统计学意义(P<0.05)。结论与SARA蛋白相比,PTD-SARA融合蛋白可以高效地进入细胞胞质及胞核,并能明显地抑制TGF-β1诱发的肾小管上皮细胞向间质细胞转分化作用,为进一步研究重组PTD-SARA融合蛋白防治肾脏纤维化奠定了基础。; 加慧卫黄晨李晶张英起孙世仁杜锐; 关键词：SARA 蛋白转导结构域融合蛋白质类纤维化

TAT蛋白转导结构域介导融合蛋白在小鼠活体的跨膜递送作用被引量：1: 2010年; 目的探讨跨膜递送短肽——TAT蛋白转导结构域(简称TAT)介导的与其融合的活性蛋白在活体的跨膜递送作用。方法以融合蛋白GST-TAT-GFP,GST-GFP-TAT和GST-GFP为研究模型蛋白,不经过蛋白质的变性处理、直接通过向小鼠腹腔注射和皮肤涂抹这两种含TAT的融合蛋白及作为对照的融合蛋白GST-GFP,一定时间作用后取体内器官和皮肤做冷冻切片,荧光显微镜检测这些融合蛋白的跨膜递送情况;并对分别融合在C端或者N端的TAT介导GFP在活体动物体内和皮肤的跨膜递送作用进行对比。结果腹腔注射实验结果表明,TAT可以介导不经过蛋白质的变性处理的融合蛋白GST-TAT-GFP和GST-GFP-TAT跨膜递送进入到小鼠的心脏、肝、肾、脾和肺,甚至脑组织;其中GST-GFP-TAT跨膜递送效率比GST-TAT-GFP更高。结构模拟分析提示GST-GFP-TAT与GST-TAT-GFP中的TAT的暴露情况不同可能是造成两种蛋白跨膜递送活性差异的重要因素。皮肤实验的结果则表明TAT不仅介导融合蛋白GST-TAT-GFP和GST-GFP-TAT进入小鼠表皮,而且使其进入小鼠皮肤的真皮层。结论 TAT可以跨膜递送不经过变性处理的融合蛋白进入小鼠皮肤和体内,递送效率可能与TAT的暴露程度相关;这些结果为在蛋白质疗法方面应用TAT提供了进一步的理论依据。; 刘树滔何火聪陈菁傅蓉潘剑茹饶平凡; 关键词：融合蛋白跨膜递送器官

TAT蛋白转导结构域的研究进展被引量：2: 2009年; 目前，应用基因重组技术人工合成治疗性蛋白质分子已经成为可能。但如何有效地将合成的蛋白质转运进入目标组织和细胞仍是当前需要解决的重大难题。蛋白转导结构域HIV-TAT的发现为体内外转运蛋白质进入细胞提供了新思路。近年来蛋白转导结构域转运蛋白质进入细胞的有效性以及其在疾病治疗中的价值已经得到不断证实。现主要对蛋白转导结构域HIV-TAT的研究进展作一综述。; 岳立辉郭娜赵砚丽; 关键词：蛋白转导结构域

蛋白转导结构域介导乙型肝炎病毒聚合酶末端蛋白重链可变区抗体体外抑制病毒的复制: 2009年; 目的蛋白转导结构域（TAT）介导HBV聚合酶末端蛋白（TP）重链可变区（VH）抗体，研究特异性TAT—VH抗体体外对HBV复制的影响。方法将TAT—VH基因克隆入原核表达载体pET28a（＋），在大肠埃希菌BL21（DE3）LysS内诱导融合蛋白表达并进行纯化。纯化的TAT—VH加入培养的HepG2．2．15细胞，间接免疫荧光法检测其导人HepG2．2．15细胞的效率，四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测其对细胞生长代谢的影响，将TATVH加入培养的HepG2．2．15细胞，定量PCR法检测HBVDNA水平。数据行单因素方差分析和t检验。结果成功制备了TAT—VH融合蛋白，间接免疫荧光及MTT证实TATVH可以跨膜导入HepG2．2．15细胞，且对细胞生长无影响．力口入5000nmol／LTAT—VH的HepG2．2．15细胞培养上清液内HBVDNA为（1．211±0．132）lg拷贝／mL，对照组为（5．325±0．041）lg拷贝／mL（t=72．91，P〈0．05）；细胞内分别为（3．521±0．411）和（8．532±0．132）lg拷贝／mL（t=28．41，P〈0．05）。结论HBV聚合酶TP区特异性TAT—VH抗体在体外可抑制HBV复制，为应用细胞内抗体治疗HBV感染提供了良好的实验基础。; 于俊岩兰林李俊刚张长江王宇明; 关键词：转导免疫球蛋白类重链病毒复制

蛋白转导结构域在抗原交叉提呈中的应用进展: 2008年; 大量实验证明,蛋白转导结构域可高效携带多种类型的物质穿越细胞膜进入细胞质。因此,将蛋白转导结构域与外源抗原连接(融合)可以促进外源抗原的交叉提呈,递送外源抗原进入MHC-Ⅰ型途径进行加工提呈,从而诱导CTL应答。本文综述了蛋白转导结构域在抗原交叉提呈中的应用进展。; 龚伟张竞梅兴国; 关键词：蛋白转导结构域抗原 CTL应答

连接蛋白转导结构域及辅助蛋白的生物活性蛋白、它的制备方法和应用: 一类连接蛋白转导结构域和辅助蛋白的生物活性蛋白及其应用。它解决了生物活性蛋白分子跨膜进入细胞的问题；它包括蛋白转导结构域、辅助蛋白和生物活性蛋白。辅助蛋白用于改善融合蛋白的表达水平、分离纯化、热稳定性和在细胞内的半衰期，...; 刘树滔饶平凡

一类具有蛋白转导结构域TAT－PTD的融合蛋白及其应用: 本发明属于基因工程技术领域，具体为一种蛋白转导结构域多肽(TAT－PTD)分别与四种抗氧化酶：人Cu/Zn超氧化物歧化酶(SOD－1)、血红素加氧酶－1(HO－1)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(PHGPx)...; 卢大儒张舒羽

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