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Uhrf1基因重组腺病毒载体构建及其在小鼠心肌细胞DNA损伤修复中的作用研究: 2024年; 目的:构建携带小鼠泛素样同源域和环指结构域1(Uhrf1)基因的重组腺病毒载体,验证Uhrf1基因在原代乳鼠心肌细胞中的表达情况,并探究其在过氧化氢(H_(2)O2)诱导的心肌细胞DNA损伤中的作用。方法:利用PCR扩增小鼠Uhrf1基因的编码序列,将其酶切后插入pADM-CMV-C-FH载体,获得重组腺病毒质粒ADM-Uhrf1。将该质粒转染至HEK293T细胞包装成重组腺病毒颗粒,数代扩增后进行腺病毒的纯化及滴度检测。分离25只1日龄ICR小鼠原代心肌细胞,分为两组,以感染复数(MOI)为50的比例分别感染ADM-Uhrf1及ADM-control(ADMCtrl),通过Western blot及免疫荧光染色验证重组腺病毒介导的UHRF1蛋白的表达,并利用H_(2)O2诱导心肌细胞DNA损伤,进而探究Uhrf1在DNA损伤修复过程中的作用。结果:通过壳蛋白免疫法检测得到的ADM-Uhrf1病毒滴度为1.8×10^(13) pfu/L。Western blot验证显示UHRF1蛋白表达水平显著升高(P<0.05),免疫荧光染色显示UHRF1主要表达在细胞核内,且Uhrf1的过表达能够显著抑制DNA损伤标志物磷酸化组蛋白H_(2)A变异体(γH_(2)AX)蛋白的表达(P<0.01)。结论:成功构建了携带小鼠Uhrf1基因的重组过表达腺病毒载体,并通过腺病毒递送系统在心肌细胞中实现了Uhrf1的过表达,且Uhrf1的过表达有效减轻了H_(2)O2诱导的心肌细胞DNA损伤。; 江南王驰寅聂宇王珏; 关键词：腺病毒载体心肌细胞 DNA损伤

表达鸭坦布苏病毒衣壳蛋白的重组腺病毒载体构建与鉴定: 2024年; 为构建鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)衣壳蛋白的复制缺陷型人5型腺病毒(Ad5)为载体的重组腺病毒,研究通过一步克隆技术将DTMUV Capsid基因插入到含有结核分枝杆菌的热休克蛋白70(mHsp70)为佐剂的pShuttle-CMV-Hsp70质粒中,构建能够表达DTMUV Capsid和mHsp70蛋白的重组穿梭质粒pShuttle-DTMUV Capsid,并与含有pAdEasy-1腺病毒骨架载体的大肠杆菌BJ5183感受态细胞进行同源重组,获得重组腺病毒质粒pAd-DTMUV Capsid。载体质粒经Pac I酶切线性化后转染至HEK 293A细胞,包装重组腺病毒rAdv-DTMUV Capsid。结果显示,rAdv-DTMUV Capsid在病毒传代过程中目的基因稳定存在,且病毒滴度可达2.3×10^(8)PFU/mL。Western blot等结果表明rAdv-DTMUV Capsid在HEK 293A细胞中表达了DTMUV特异性蛋白Capsid。DEF细胞感染试验证明rAdv-DTMUV Capsid可感染鸭源细胞,且诱导IFN-α、IL-10和IL-17 mRNA表达。结果表明,研究成功制备表达DTMUV Capsid蛋白的重组腺病毒rAdv-DTMUV Capsid,能引起细胞免疫反应,可作为一种候选疫苗。; 吴庆国李莎莎王安平卢会鹏成玉婷; 关键词：衣壳蛋白重组腺病毒 HSP70

一种基因编辑的腺病毒载体构建方法及应用: 本发明公开了一种基因编辑的腺病毒载体构建方法及应用，属于基因编辑技术领域，将pDC316‑ZsGreen1‑shRNA质粒用ECOR I限制性内切酶和Mfe I限制性内切酶进行双酶切，胶回收得到线性化好的腺病毒载体；扩增...; 刘登辉施荣辉周金山袁昌建郑康

胸膜肺炎放线杆菌ApxⅡ蛋白重组腺病毒载体构建及免疫原性研究: 2023年; 研究旨在构建胸膜肺炎放线杆菌ApxⅡ蛋白的复制缺陷型5型腺病毒载体的重组腺病毒。构建包含胸膜肺炎放线杆菌ApxⅡ基因的穿梭质粒pDC316-APXⅡ,并与腺病毒骨架质粒pBHGlox(delta)E13Cre共转染Hek293细胞,获得了重组腺病毒rAd-APXⅡ,将纯化后的重组腺病毒rAd-APXⅡ肌肉注射小鼠进行免疫原性分析。结果显示,试验成功构建了pDC316-APXⅡ质粒以及包装了rAd-APXⅡ病毒。rAd5-Null组未产生特异的APXⅡIgG抗体;低和高浓度rAd-APXⅡ组均可产生较高的APXⅡIgG抗体,其中高浓度组产生的抗体水平显著高于低浓度组(P<0.05);某疫苗组产生的抗体水平显著高于rAd-APXⅡ低浓度组(P<0.05),但低于rAd-APXⅡ高浓度组(P<0.05)。低、高浓度rAd-APXⅡ组和疫苗组的IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3抗体显著高于rAd-Null组(P<0.05);高浓度rAd-APXⅡ组和疫苗组抗体显著高于低浓度rAd-APXⅡ组(P<0.05)。研究表明,rAd-APXⅡ重组腺病毒免疫小鼠能够产生特异性抗体并显示良好的免疫原性。; 颜运秋黎满香赵枭健龙娉; 关键词：猪传染性胸膜肺炎胸膜肺炎放线杆菌重组腺病毒免疫原性

RGS5过表达腺病毒载体构建及其在神经元发育中作用的初步研究: 2022年; 目的利用AdEasy腺病毒载体系统构建G蛋白信号调节蛋白5(regulator of G-protein signaling 5,RGS5)重组腺病毒载体,初步探讨RGS5在神经元发育过程中的作用。方法以C57BL/6小鼠大脑皮层神经元cDNA为模板,利用PCR扩增RGS5基因,构建腺病毒重组质粒pAD-Track-RGS5。重组质粒pAD-Track-RGS5经PacI酶切线性化后与pADEasy-1骨架质粒共同转化BJ5183感受态细胞,筛选重组成功的质粒,命名为pAD-RGS5。用293A细胞包装重组腺病毒AD-RGS5,并纯化病毒,以pAD-Track包装的腺病毒(AD-EGFP)作为对照组检测重组腺病毒RNA水平RGS5表达情况。将重组腺病毒AD-RGS5感染培养的原代皮层神经元,以AD-EGFP作为对照组检测RGS5对原代皮层神经元发育的影响。结果与Neuro 2a、CATH.a和C17.2细胞系比较,大脑原代皮层神经元RGS5相对表达量明显升高,差异具有统计学意义(t值分别为7.40、7.58和7.60,P值均<0.05)。pAD-Track-RGS5转染Hela细胞中RGS5表达量较pAD-EGFP组明显升高,差异显著具有统计学意义(t=7.58,P<0.05),成功构建了过表达RGS5基因的腺病毒载体。与AD-EGFP腺病毒组相比,AD-RGS5腺病毒组神经元对突触囊泡内吞的能力变弱,荧光染色变弱,差异具有统计学意义(t=5.372,P<0.05),提示RGS5对皮层神经元的突起发育具有明显的抑制作用。结论成功构建了RGS5过表达的AD-RGS5腺病毒载体,RGS5对原代皮层神经元胞吞突触囊泡的能力有抑制作用。; 赵崴刘传亮徐昊李高驰王金彩; 关键词：腺病毒神经元

血红素氧合酶1和骨形态发生蛋白2共表达腺病毒载体构建及其对酒精性股骨头坏死治疗的研究被引量：2: 2022年; 目的探讨血红素氧合酶1(HO-1)和骨形态发生蛋白-2(BMP-2)在酒精作用下对成骨细胞凋亡的影响。方法利用腺病毒载体分别构建HO-1、HO-1+BMP-2过表达成骨细胞株H-FOB1-19、HB-FOB1-19及空载载体对照组NC-FOB1-19,实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测成骨细胞中BMP-2和HO-1的表达水平;蛋白质印迹法(Western blot)检测H-FOB1-19、HB-FOB1-19 HO-1、NC-FOB1-19中HO-1及表达水平。90 mmol/L酒精分别处理上述3组成骨细胞,流式细胞术(FCM)检测酒精处理后各组成骨细胞的凋亡率。两组比较采用t检验。结果qRT-PCR表明H-FOB1-19、HB-FOB1-19组HO-1表达量高于NC-FOB1-19组(3.872±0.286、3.940±0.653比1.010±0.139,t=10.220、6.206,P<0.05)];HB-FOB1-19组中BMP-2的表达量明显高于NC-FOB1-19组(3.573±0.744比1.183±0.025,t=4.678,P<0.05);Western blot表明HO-1在HB-FOB1-19、H-FOB1-19中的表达量为NC-FOB1-19中表达量的(2.03±0.24)、(1.75±0.16)倍,BMP-2在HB-FOB1-19、H-FOB1-19中的表达量为NC-FOB1-19中表达量的(1.92±0.21)、(1.18±0.09)倍;流式细胞术检测90 mmol/L乙醇处理NC-FOB1-19、H-FOB1-19、HB-FOB1-19组成骨细胞,NC-FOB1-19组凋亡率明显高于H-FOB1-19、HB-FOB1-19组[(23.12±0.14)%比(18.17±0.19)%、(13.59±1.30)%,t=7.073、12.670,P<0.05],HB-FOB1-19组的凋亡率低于H-FOB1-19组[(18.17±0.19)%比(13.585±1.295)%,t=6.640,P<0.05]。结论成骨细胞中过表达HO-1可降低酒精作用后成骨细胞凋亡率,同时上调HO-1和BMP-2表达上述作用效果更明显。; 杜振宁王冰一高强李杰; 关键词：酒精性股骨头坏死腺病毒载体血红素氧合酶1 骨形态发生蛋白-2

共表达腺病毒载体构建鉴定及其转染骨髓间充质干细胞观察被引量：2: 2021年; 目的:构建并鉴定绿色荧光蛋白标记的人骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)2和血管内皮生长因子(vascular endotheliel growth factor,VEGF) 165双基因共表达的重组腺病毒,为研究该双基因对骨髓间充质干细胞成骨方向诱导和体内骨缺损修复作用奠定基础。方法:从cDNA文库中PCR扩增BMP2和VEGF165目的基因,并将其插入腺病毒穿梭质粒pAd-MCMV-GFP的多克隆位点,将构建的重组穿梭质粒pAd-MCMV-BMP2-VEGF165和腺病毒辅助质粒pBHGloxΔE1,3Cre共转染细胞HEK293细胞内,经历腺病毒基因重组及出毒后收集细胞,多次冻融离心获取病毒溶液(Ad-BMP2-VEGF165)。进一步纯化并测定病毒滴度,随后通过转染兔骨髓间充质干细胞并检测BMP2和VEGF165双目的基因表达和倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达。结果:基因测序、菌落PCR、Western blotting、Real-time PCR、绿色荧光蛋白表达均表明载体Ad-BMP2-VEGF165构建成功,可稳定转染骨髓间充质干细胞内并稳定表达,经测定腺病毒载体滴度达到l×10^(10) PFU/ml。结论:携带人BMP2和VEGF165双基因共表达重组腺病毒载体构建成功,并能获得高滴度的病毒感染液。; 李千会孟纯阳麻凤玉张聪; 关键词：骨形态发生蛋白腺病毒载体骨髓间充质干细胞

HGF基因重组腺病毒载体构建及其转染对大鼠骨髓间充质干细胞增殖和迁移的影响被引量：1: 2021年; 目的构建携带大鼠肝细胞生长因子(HGF)基因的重组腺病毒载体,并转染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),检测其在BMSCs的表达、以及对BMSCs增殖和迁移的影响。方法利用全基因合成方法得到目的基因HGF序列,将HGF基因片段与穿梭质粒pDC316-mCMV-增强绿色荧光蛋白(EGFP)连接,构建含有目的基因的pDC316-mCMV-EGFP-HGF重组质粒,经过病毒包装及扩增,获得带有荧光报告基团EGFP与HGF基因的重组腺病毒载体pDC316-mCMV-EGFP-HGF。将pDC316mCMV-EGFP-HGF重组腺病毒载体转染BMSCs细胞,通过ELISA检测HGF表达水平,CCK-8法检测BMSCs增殖能力,Transwell法检测BMSCs迁移。结果构建了表达HGF基因和荧光报告基因EGFP的重组腺病毒载体pDC316-mCMV-EGFP-HGF,转染BMSCs后,BMSCs细胞HGF表达水平、增殖及迁移均明显高于非转染组(P<0.05)。结论成功构建pDC316-mCMV-EGFP-HGF重组腺病毒载体,可以介导HGF在BMSCs中稳定表达,并提高BMSCs增殖及迁移能力。; 罗晓红曾雯巨容; 关键词：肝细胞生长因子腺病毒骨髓间充质干细胞迁移

一种用于腺病毒载体构建的携带双顺反子的穿梭质粒及构建: 本发明提出了一种用于腺病毒载体构建的携带双顺反子的穿梭质粒及构建，利用腺病毒穿梭载体pShuttle为基础质粒，在多克隆位点上利用限制性核酸内切酶KpnI和Bgl II插入内部核糖体进入位点元件序列，从而构建了一个包含双...; 王家宁

Tet-on调控BMP-2基因表达的腺病毒载体构建: 2020年; 目的构建Tet-on调控BMP-2基因腺病毒载体,并对其相关指标进行鉴定,为骨质疏松性骨折的基因治疗提供新的方法。方法以含有目的基因的pDC315-BMP-2质粒为模板,将目的基因克隆至pAdenoX-Tet-On 3G Vector中,构建pAdenoBMP-2-Tet-On表达质粒。将构建的pAdenoBMP-2-Tet-On表达质粒转染Adeno-X 293细胞,完成腺病毒扩增,PCR鉴定扩增产物,并利用Adeno-X Rapid Titer Kit检测病毒滴度。结果酶切及PCR结果显示BMP-2被成功导入Tet-on腺病毒载体中,并成功转染Adeno-X 293细胞,包装及扩增后得到Tet-on调控BMP-2基因的腺病毒载体,滴度为1x1010ifu/ml。结论成功构建了Tet-on调控BMP-2基因的腺病毒载体。; 温家宾肖裕华陈钢李宇旭龚飞鹏; 关键词：骨形态发生蛋白腺病毒骨质疏松性骨折

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