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BVDV中E^(rns)、N^(pro)蛋白真核表达质粒的构建: 2024年; 目的:试验旨在构建牛病毒性腹泻病毒(BVDV)结构蛋白(糖基化囊膜蛋白E^(rns))和非结构蛋白(N^(pro))重组表达载体,利用哺乳动物真核表达系统对E^(rns)、N^(pro)进行表达.方法:参考GenBank中公布的BVDV参考株核苷酸序列分别设计引物N^(pro)-F/R和E^(rns)-F/R,用BVDV病毒的cDNA进行PCR扩增,将回收纯化的N^(pro)和E^(rns)目的基因和真核表达载体pCMV-Myc进行双酶切.利用琼脂糖凝胶电泳进行回收纯化,将回收纯化产物采用T4 DNA连接酶进行连接并转化至BL-21感受态细胞中,构建真核表达质粒,将重组质粒命名为pCMV-Myc-N^(pro)和pCMV-Myc-E^(rns).双酶切及测序鉴定正确后转染HEK-293细胞,采用PCR及Western blotting检测N^(pro)和E^(rns)在细胞内的表达.结果:pCMV-Myc-N^(pro)和pCMV-Myc-E^(rns)真核表达质粒构建成功,N^(pro)和E^(rns)在HEK293细胞中成功表达.结论:N^(pro)、E^(rns)蛋白的成功表达可为探究蛋白质生物学功能、研究病毒感染机制及研制亚单位疫苗提供理论参考.; 巩转娣裴梦源拜小强袁肇方李殿玉魏锁成; 关键词：牛病毒性腹泻病毒结构蛋白真核表达

B602L蛋白的真核表达质粒、B602L蛋白、用途、检测体系: 本申请属于生物领域，公开了一种非洲猪瘟B602L蛋白的真核表达质粒，所述质粒包括载体以及连接于载体中经过改造的AFSV B602L基因；所述经过改造的AFSV B602L基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该质...; 刘郁夫温健怡雷颖简艳珊林子欣林喜琪彭杰姚淑华何海婵

FMDV 3D基因真核表达质粒的构建、表达及对Ⅰ型IFN信号通路的作用被引量：1: 2024年; 本研究旨在构建口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)3D基因真核表达质粒,并探究其对Ⅰ型干扰素(interferon,IFN)信号通路的作用。根据GenBank序列合成3D基因并将其插入真核表达载体pXJ41构建真核表达质粒pXJ41-Myc-3D,经PCR、双酶切及测序鉴定正确后分别转染HEK-293T细胞和PK-15细胞,Western blotting及间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)检测3D蛋白在细胞内的表达及定位。通过双荧光素酶报告基因(Luciferase)、Real-time PCR、TCID50等试验检测HEK-293T细胞中过表达3D蛋白对水疱性口炎病毒(Versicular stomatitis virus,VSV)诱导的Ⅰ型IFN信号通路的影响。结果显示,真核表达质粒pXJ41-Myc-3D构建成功;3D蛋白在HEK-293T细胞中表达,大小约为55 kDa,主要定位在细胞核中;3D蛋白抑制了VSV诱导的IFN-β启动子活性和IFN-β mRNA水平,促进了VSV的复制。本研究为深入探究3D蛋白抑制Ⅰ型IFN信号通路的作用机制奠定了基础。; 苗勤吴香菊齐静丛晓燕丛晓燕王林李均同; 关键词：口蹄疫病毒真核表达

mCherry标签融合SATB1真核表达质粒的构建: 2023年; 核基质结合蛋白SATB1调控染色质的空间结构,参与真核生物基因表达。本论文通过PCR获得SATB1目的基因,然后与载体mCherry-C1同时用EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切后,用T4连接酶进行连接。连接质粒转入感受态宿主细胞并在Kana抗性的LB培养基中培养。分离获得Kana抗性单克隆菌株并进行扩大培养后提取重组质粒。对重组质粒进行双酶切验证和DNA测序检测。本论文成功构建mCherry-SATB1真核表达质粒,为后续研究SATB1的功能机制奠定基础。; 齐文靖杨壮韩国军; 关键词：SATB1 质粒构建 DNA测序

猪TRIM56全长及其截短体真核表达质粒的构建及蛋白的表达和定位: 2023年; 本研究构建了猪TRIM56(sTRIM56)全长及其截短体的真核表达质粒,并检测了其融合蛋白的表达和定位。首先,根据sTRIM56基因序列及结构特点,设计扩增全长及4个截短体的引物,提取猪肺泡巨噬细胞3D4/21的总RNA,RT-PCR扩增sTRIM56全长及截短体基因,并将其克隆至pXJ41真核表达载体,构建全长及其截短体的真核表达质粒。其次,将sTRIM56全长及截短体真核表达质粒转染HEK-293T细胞,Western blotting检测其蛋白表达;转染猪肺泡巨噬细胞3D4/21,间接免疫荧光试验(IFA)检测其亚细胞定位。双酶切和测序结果显示,sTRIM56全长及截短体的真核表达质粒构建成功;sTRIM56蛋白约为82 kDa,与预期相符,各截短体蛋白条带也与预期相符;sTRIM56全长及4个截短体蛋白均主要定位于细胞质中。本研究结果可为后续深入研究sTRIM56蛋白及其不同结构域的抗病毒作用及分子机制奠定基础。; 姚来娣吴香菊齐静丛晓燕李均同贾杏林杜以军; 关键词：真核表达质粒

鸡IL-17A真核表达质粒的构建及其对IBD rVP2亚单位疫苗的免疫佐剂效应被引量：2: 2023年; 为探究鸡白介素-17A(IL-17A)真核表达质粒对鸡传染性法氏囊病(IBD)rVP2亚单位疫苗的免疫佐剂效应,本研究采用RT-PCR方法扩增鸡IL-17A基因,将其克隆于原核表达载体pET-28a中,构建重组质粒pET-28a-chIL-17A,将其转化BL21(DE3)大肠杆菌,诱导表达重组蛋白rchIL-17A,通过SDS-PAGE检测后,经His色谱层析柱纯化rchIL-17A,纯化蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,并通过ELISA鉴定。同时将鸡IL-17A基因克隆于真核表达载体pVAXI中构建重组质粒pVAX-chIL-17A,将pVAX-chIL-17A肌肉注射鸡7 d后经western blot检测其的表达。将21日龄SPF鸡随机分为4组,分别为对照组、pVAX-chIL-17A组、rVP亚单位疫苗组、pVAX-chIL-17A+rVP亚单位疫苗组,免疫后通过ELISA检测各组鸡血清中IBD病毒(IBDV)特异性抗体水平(0、14 d、28 d、42 d和56 d)和IL-2、IL-4、IL-6、IL-17A、IFN-γ及TNF-α的分泌水平(28 d),通过流式细胞术检测各组鸡脾细胞中CD4+T和CD8+T细胞亚群的比例(14 d和28 d)。RT-PCR扩增结果显示获得了约为420 bp的目的片段,并构建原核表达质粒后经诱导纯化后得到了rchIL-17A;将其免疫小鼠后经ELISA检测,结果显示获得了其多克隆抗体。将构建的重组质粒pVAX-chIL-17A免疫鸡后,western blot分析结果显示,注射部位肌肉组织中目的蛋白正确表达。将SPF鸡分组免疫后,ELISA检测结果显示,pVAX-chIL-17A+IBD rVP2亚单位疫苗组各时间点的IBDV特异性抗体水平均显著或极显著高于rVP2亚单位疫苗单独免疫组(P<0.05、P<0.01、P<0.001);pVAX-chIL-17A单独及与rVP2亚单位疫苗共同免疫28 d后,鸡血清中IL-2、IL-6、IL-17A及TNF-α的分泌水平相较其它组显著提高(P<0.05、P<0.01),而IFN-γ和IL-4分泌水平无明显变化。流式细胞术检测结果显示,与对照组相比,单独免疫pVAX-chIL-17A 14 d及28 d后鸡脾细胞中CD4+T和CD8+T细胞的占比均极显著增加(P<0.01、P<0.001);与rVP亚单位疫苗单独免疫组相比,pVAX-chIL-17A与rVP2亚单位疫苗; 王玉俭郑倩解欣斐; 关键词：真核表达

6种转录本人早幼粒细胞性白血病基因真核表达质粒的构建及其重组蛋白的亚细胞定位分析: 2023年; 目的构建6种转录本人早幼粒细胞性白血病(human promyelocytic leukaemia,hPML)基因的真核表达质粒,并分析其重组蛋白的亚细胞定位情况。方法根据GenBank中登录的hPML基因序列设计引物,RT-PCR法扩增获得6种转录本hPML基因片段(hPMLⅠ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ),分别连接至真核表达载体pCAGGS,获得6种转录本hPML基因的真核表达质粒。将6种真核表达质粒分别转染293T细胞,Western blot法检测蛋白表达情况;分别转染至Vero细胞,间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay,IFA)法检测亚细胞定位情况。结果 6种真核表达质粒中的目的基因片段均与GenBank中登录的hPML基因序列一致。6种重组蛋白均可与Myc抗体发生特异性结合,其中重组蛋白hPMLⅠ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ定位于细胞核及细胞质内,重组蛋白hPMLⅦ主要定位于细胞质,极少定位于细胞核中。结论构建的6种转录本hPML基因真核表达质粒均可在哺乳动物细胞中正确表达,表达的重组蛋白同时定位于细胞核及细胞质或主要定位于细胞质中。本研究为重组蛋白hPML抗病毒等生物学功能的深入研究提供了实验依据。; 蔺玉刚马春玲杨雪龚真莉岳亚辉王芳萍郜晓虹任善会孙跃峰陈豪泰焦海宏; 关键词：转录本真核表达亚细胞定位

非洲绿猴FILIP1L真核表达质粒的构建及其抑制PEDV复制的研究: 2023年; 为探究FILIP1L(filamin A-interacting protein 1-like)蛋白对猪流行性腹泻病毒(PEDV)的影响,以Vero细胞中提取的总RNA反转录的cDNA为模板,PCR扩增出FILIP1L基因,克隆到p3×FLAG-CMV-10真核表达载体上。过表达或沉默FILIP1L基因,通过免疫印迹和定量PCR检测FILIP1L蛋白的表达情况,并研究其抗病毒功能。结果:成功构建3×FLAG-CMV-10-FILIP1L重组质粒,转染后能够正常表达。PEDV感染Vero细胞后,FILIP1L基因的mRNA表达显著上调;过表达FILIP1L基因显著抑制PEDV的复制;下调FILIP1L的表达可显著促进PEDV的复制。综上,FILIP1L蛋白能够抑制PEDV在Vero细胞的复制,研究结果为寻找新的抗PEDV药物靶点和研发新型疫苗提供理论依据。; 汤学超李运川张雪寒范宝超朱雪蛟周金柱赵永祥郭容利李彬李彬; 关键词：猪流行性腹泻病毒抗病毒

鼠源pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85真核表达质粒的构建及其部分功能研究被引量：1: 2023年; 目的构建鼠源pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85真核表达质粒,并观察其对脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞中炎症相关因子分泌的影响及对RAW264.7细胞增殖和凋亡的影响。方法通过PCR扩增NUP85基因,构建pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85真核表达质粒。将pcDNA3.1-3×Flag-c载体进行酶切。纯化的PCR产物与载体连接,将连接产物转化细菌感受态细胞。酶切鉴定后,再进行测序和比对分析。然后将其转染至RAW264.7细胞中,通过CCK-8实验和流式细胞术检测其对LPS诱导的RAW264.7细胞增殖和凋亡的影响,并通过Western blot技术和ELISA法检测RAW264.7细胞中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)的表达情况。结果酶切鉴定和Western blot结果显示pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85真核表达质粒成功构建和表达。CCK-8实验结果显示:24 h后过表达NUP85组细胞的存活率显著低于对照组[(0.55±0.03)vs(0.67±0.05),F=30.98,P<0.05]。流式细胞术结果显示:过表达NUP85组细胞的凋亡率高于对照组[(15.78±1.05)%vs(13.40±0.47)%,F=75.38,P<0.05]。Western blot和ELISA结果显示:转染pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85质粒后,RAW264.7细胞中的TNF-α、IL-6表达较对照组升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论NUP85能够抑制LPS刺激的RAW264.7细胞的增殖并促进其凋亡,并且NUP85促进LPS刺激的RAW264.7细胞中炎症因子IL-6和TNF-α的表达。; 姚燕王淑贤吴银翠胡爽胡颖潘林鑫徐涛; 关键词：RAW264.7细胞肿瘤坏死因子-Α 白细胞介素-6

转染IGF2BP3基因siRNA和真核表达质粒的神经母细胞瘤细胞侵袭凋亡变化观察: 2023年; 目的观察转染胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白3(IGF2BP3)基因siRNA和真核表达质粒的神经母细胞瘤(NB)细胞侵袭凋亡变化,以探讨IGF2BP3基因对NB细胞侵袭和凋亡的影响。方法选取NB细胞株IMR-32、SK-N-BE(2)、BE(2)-C、SH-SY-5Y,采用qRT-PCR检测IGF2BP3 mRNA、Western blotting法检测IGF2BP3蛋白、Transwell实验观察NB细胞的体外侵袭能力。根据上述实验结果,选择IGF2BP3表达水平最高的SK-N-BE(2)细胞及IGF2BP3表达水平最低的IMR-32细胞作为后续实验细胞。SK-N-BE(2)细胞转染针对IGF2BP3基因的小干扰RNA(siRNA)(SK-siIGF2BP3组),并设立细胞对照组(SK-Control组,只含有脂质体)和siRNA对照组(SK-siNC组,转染阴性对照序列)。IMR-32细胞转染IGF2BP3真核表达质粒(IMR-IGF2BP3组),并设立细胞对照组(IMR-Control组,只含有脂质体)和空载体对照组(IMR-Vector组,转染空载体)。转染成功后,采用qRT-PCR、Western blotting法和细胞免疫荧光染色法检测各组IGF2BP3 mRNA及蛋白,Transwell实验观察各组细胞侵袭能力,流式细胞术测算各组NB细胞凋亡率,Western blotting法检测各组细胞侵袭相关蛋白E-cadherin、N-cadherin、Vimentin。结果与SKControl组和SK-siNC组相比,SK-siIGF2BP3组IGF2BP3 mRNA、蛋白相对表达量降低,穿越Transwell小室膜细胞数减少,凋亡率升高(P均<0.05);与IMR-Control组和IMR-Vector组相比,IMR-IGF2BP3组IGF2BP3 mRNA、蛋白相对表达量升高,穿越Transwell小室膜细胞数增加,凋亡率降低(P均<0.05)。在SK-N-BE(2)细胞中,与SK-siNC组及SK-Control组比较,SK-siIGF2BP3组中N-cadherin、Vimentin蛋白相对表达量下降,E-cadherin蛋白相对表达量上升(P均<0.05);在IMR-32细胞中,与IMR-Vector组、IMR-Control组比较,IMR-IGF2BP3组N-cadherin和Vimentin蛋白相对表达量升高,E-cadherin蛋白相对表达量下降(P均<0.05)。结论转染IGF2BP3基因siRNA的NB细胞侵袭能力减弱、凋亡率增加,转染IGF2BP3真核表达质粒的NB细胞侵袭能力增强、凋亡率�; 朱凯朱凯高婷婷吕志宝; 关键词：神经母细胞瘤小干扰核糖核酸细胞侵袭

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