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应用细菌双杂交系统技术寻找与人PCIA1基因相互作用的基因被引量：1: 2007年; 目的探寻与新近发现的人类交叉免疫反应抗原（homo sapiens cross-immune reaction antigen）基因PCIA1相互作用的基因,为其功能研究提供线索。方法应用Stratagene公司的细菌双杂交系统和人胚肾cDNA文库,构建诱饵质粒pBT-PCIA1,与靶质粒pTRG-cDNA文库大规模地共转化报告菌株,筛选并分离具有相互作用的pTRG-cDNA阳性克隆,经DNA序列分析和生物信息学确定靶基因。结果发现7种靶蛋白基因,其中3种基因功能尚不清楚,其余4种具有重要生理功能,突变或表达异常都会导致严重疾病;α-辅肌动蛋白-4（actinin,alpha4,ACTN4）、鞘脂激活蛋白原（prosaposin,PSAP）或真核翻译起始因子（eukary-otic translation initiation factor 3,subunit 10 theta,EIF3S10）过表达都会促进肿瘤发生和演进。结论细菌双杂交系统技术探测蛋白质之间的相互作用,是一种提供新基因功能研究信息的有效方法;PCIA1基因表达与肿瘤形成、侵袭和转移密切相关。; 李祖茂文艳君来松涛倪睿邓洪新阚兵李炯刘钧敬小梅程平石薇贾永喜; 关键词：双杂交系统技术

PCR-反向点杂交法检测复治涂阳患者结核分枝杆菌耐药性的价值被引量：4: 2021年; 目的评估PCR-反向点杂交法检测复治涂阳患者痰标本中MTB耐药性的价值。方法收集2015年6月至2019年1月上海市肺科医院诊治的400例复治涂阳肺结核患者的痰标本,每份标本量均不少于2ml;每例患者采用同一标本进行PCR-反向点杂交法MTB耐药基因检测、GeneXpert MTB/RIF检测和BACTEC MGIT960液体培养、菌种鉴定、微孔板法药物敏感性试验(简称"药敏试验"),最终纳入357例(株)为研究对象。以微孔板法药敏试验结果为参考标准,评价PCR-反向点杂交法的检测效能。结果以微孔板法药敏试验结果为参考标准,PCR-反向点杂交法检测MTB对利福平耐药性的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、符合率和Kappa值分别为97.5%(115/118)、97.1%(232/239)、94.3%(115/122)、98.7%(232/235)、97.2%(347/357)和0.937,对异烟肼耐药性的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、符合率和Kappa值分别为82.5%(113/137)、99.1%(218/220)、98.3%(113/115)、90.1%(218/242)、92.7%(331/357)和0.841,对链霉素耐药性的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、符合率和Kappa值分别为86.5%(115/133)、99.1%(222/224)、98.3%(115/117)、92.5%(222/240)、94.4%(337/357)和0.877,对乙胺丁醇耐药性的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、符合率和Kappa值分别为60.7%(37/61)、98.6%(292/296)、90.2%(37/41)、92.4%(292/316)、92.2%(329/357)和0.682。结论 PCR-反向点杂交法检测复治涂阳患者痰标本中MTB耐药性有较好的效能。; 刘轾彬吴敏吴小翠韩敏肖和平张青; 关键词：微生物敏感性试验双杂交系统技术

C2株蓝氏贾第鞭毛虫cDNA文库的构建被引量：2: 2018年; 目的构建C2株蓝氏贾第鞭毛虫cDNA文库。方法 Trizol对C2株贾第虫滋养体RNA进行提取,逆转录获得cDNA单链,LD-PCR扩增获得ds cDNA,经纯化后,与pGADT7-Rec共转化酵母株Y187中。通过营养缺陷型平板SD/-Leu培养获得转化子即包含蓝氏贾第鞭毛虫cDNA文库,并对文库的库容及DNA重组率进行鉴定。结果以RNA为模板,经逆转录、LD-PCR、纯化等,得到了较为理想的双链cDNA。将ds cDNA和pGADT7-Rec转化到酵母菌株,经分离培养,最终得到转化成功的酵母转化子,建立了贾第虫的cDNA文库,文库容量为2.715×107/mL,重组率76.7%,插入片段的大小主要集中在300~1 000。结论成功的构建了较为理想的C2株贾第虫cDNA文库。; 刘绍伟王洋田喜凤; 关键词：基因文库双杂交系统技术

SIGIRR胞内区酵母双杂交诱饵质粒的构建及自激活作用检测: 2014年; 目的：构建单免疫球蛋白白细胞介素-1受体相关蛋白（SIGIRR）胞内区酵母双杂交诱饵质粒，并检测其是否存在自激活作用。方法聚合酶链反应（PCR）扩增人SIGIRR胞内区基因片段（480～1230 bp），并将此基因片段重组入pSos载体中，构建诱饵质粒pSos-SIGIRR ，经酶切及测序鉴定构建正确后，将重组质粒与对照质粒共转化感受态酵母菌cdc25H ，接种于25℃SD/Glucose（-UL）和SD/Galactose（-UL）平板以及37℃ SD/Glucose（-UL）和SD/Galactose（-UL）平板上，连续观察6 d酵母菌生长状况；用Western blot法检测目的蛋白表达情况。结果正确构建了人SIGIRR胞内区酵母双杂交诱饵质粒pSos-SIGIRR ， pSos-SIGIRR在酵母双杂交系统中无自激活及毒性作用。Western blot结果显示，目的蛋白以170＆#215;103的融合蛋白形式表达。结论诱饵质粒pSos-SIGIRR可应用于酵母双杂交系统中，为在人肺互补脱氧核糖核酸（cDNA ）文库中寻找与SIGIRR相互作用蛋白奠定了重要基础。; 陈旭昕冯华松段蕴铀吴学玲钱桂生; 关键词：双杂交系统技术自激活

利用双杂交系统筛选并鉴定与GPR30相互作用的蛋白被引量：1: 2013年; 目的筛选并鉴定与GPR30相互作用的蛋白,为GPR30蛋白亚细胞定位和功能研究提供线索。方法应用酵母双杂交技术,构建诱饵表达载体Pgbk/GPR30,与人卵巢互补DNA(complementary DNA,cDNA)文库共转化酵母菌AH109,筛选阳性克隆并测序。利用哺乳动物双杂交系统验证GPR30与候选蛋白的相互作用。结果从人卵巢cDNA文库中筛选出4个与GPR30结合的蛋白基因,分别是小G蛋白Rab8a、Rab40a、NM23-H2和TACC3。其中,小G蛋白Rab8a、Rab40a与GPR30的相互作用在哺乳动物双杂交系统中得到验证。结论小G蛋白Rab8a和Rab40a可能参与了GPR30细胞内转运或与GPR30参与的信号转导有关。; 张蕾常宏徐东; 关键词：受体雌激素双杂交系统技术卵巢

增生性瘢痕成纤维细胞中羟基丙酮酸异构酶同系物结合结构域分析被引量：2: 2012年; 目的了解增生性瘢痕Fb中羟基丙酮酸异构酶同系物（HYI）与P311蛋白相互作用的结合区域. 方法（1）以克隆有P311的pMD18-T质粒为模板,对P311进行PCR扩增；Trizol法提取人增生性瘢痕Fb的总RNA,对HYI进行RT-PCR扩增,采用双酶切法分别构建pGA DT7-P311和pGBKT7-HYI重组载体,PCR及测序验证.采用Prot Seale软件和HNN软件对HYI蛋白进行二级结构分析,据此结果扩增HYI-1（1 ～447 bp）、HYI-2（247 ～447 bp）、HYI-3（1 ～279 bp）、HYI-4（247 ～654 bp）片段,双酶切法构建pGBKT7-HYI-1、2、3、4重组载体,经PCR及测序验证.（2）采用醋酸锂法将酵母细胞AH109制备成感受态细胞,粗略等量分为HYI全长与HYI-1、2、3、4杂交组,以及阳性对照组和阴性对照组.采用聚乙二醇-醋酸锂法,前5组分别同时转化pGBKT7-HyI全长、各片段的重组载体与pGADT7-P311重组载体,后2组分别同时转化pGBKT7-53与pGADT7-RecT重组载体、pGBKT7-Lam与pGADT7-RecT重组载体.转化后即刻,取各组部分细胞分别涂布在缺乏亮氨酸、色氨酸、腺嘌呤及组氨酸的培养基（简称四缺培养基）上,另取各组部分细胞分别涂布在缺乏亮氨酸和色氨酸的培养基（简称二缺培养基）上,培养3～6d,观察菌株生长情况,5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷显色反应检测菌落β半乳糖苷酶表达. 结果（1）克隆出的P311片段与Genbank中P311（序号hsu36189）序列一致.与Genbank中HYI（序号AY775560）序列对比,HYI基因扩增片段在496 bp处的A替换为了G.经验证各重组载体插入片段无误.（2）计算机模拟结果显示,组成HYI蛋白的216个氨基酸中,可能形成α螺旋的氨基酸有101个,可能形成无规则卷曲的氨基酸有90个,可能形成延伸链的氨基酸有25个.（3）HYI-1、2、3、4克隆片段大小与预期相符,经验证各重组载体插入片段无误.（4）除阴性对照组菌株未见在四缺培养基上生长外,其他组菌株均在2种培养基上生长,�; 汪静刘洋张克马兵赵云; 关键词：瘢痕成纤维细胞双杂交系统技术

HNP-3相互作用蛋白的酵母双杂交筛选: 2011年; 目的筛选胎肾上腺cDNA文库中与人中性粒细胞多肽(HNP-3)成熟肽具有相互作用的蛋白分子。方法通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)成功获得HNP-3成熟肽基因,并将其插入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转染酵母细胞AH109,而后经缺陷性培养基上培养并观察pGBKT7-HNP-3在AH109中的表达情况,检测诱饵载体有无毒性作用和自激活功能。同时收集胎肾上腺,提取RNA,通过自我检测、分析、报告技术(SMART技术)制备人胎肾上腺cDNA文库。并采用Match-maker LexA酵母双杂交系统从胎肾上腺cDNA文库中筛选与HNP-3成熟肽相互作用的蛋白。最后通过PCR筛选获得阳性克隆并测序,通过回转实验,谷胱甘肽巯基转移酶沉降技术(GST pull down)以及免疫共沉淀实验再次验证二者的相互作用关系。结果成功构建诱饵质粒pGBK-T7-HNP-3以及胎肾上腺cDNA文库并在酵母细胞中正确表达,筛选获得HNP-3成熟肽相互作用的蛋白——促肾上腺皮质激素受体(ACTH-R)2、钙粘着蛋白关联蛋白1(CTNNB1)、低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LRP5)、成对样同源域转录因子2(PITX2)等。最终选定ACTH-R作为主要研究对象,且经GST pull down以及免疫共沉淀实验获得了证实二者间具有相互作用的相应的条带。结论从胎肾上腺cDNA文库中成功筛选得到α防御素HNP-3成熟肽相互作用蛋白——ACTH-R。; 张伟义邓璐霞黄宁朱涛; 关键词：双杂交系统技术

用酵母双杂交技术筛选与HSPC016相互作用的蛋白: 2011年; 目的采用酵母双杂交技术筛选毛乳头细胞中与造血干细胞（hematopoietic stem/progenitor cells,HSPC）分化相关基因HSPC016相互作用的蛋白,了解其参与调控毛乳头细胞凝集性生长的分子机制.方法应用酵母双杂交系统,将构建的pGBKT7-HSPC016诱饵质粒与含原代人毛乳头细胞cDNA文库质粒的酵母Y187进行配合,筛选与HSPC016相互作用的蛋白,通过回复性杂交试验验证其可靠性,并对阳性克隆进行测序和生物信息学分析.结果筛选出4个与HSPC016有相互作用的蛋白,包括转录因子叉头框蛋白O1（forkhead box O1,FOXO1）、丝裂原活化蛋白激酶11、磷酸次黄苷酸激酶3调节亚单位3（PIK3R3）、肝X受体,它们均与细胞内能量代谢、转录调节相关.结论 HSPC016可能通过参与细胞内活性氧水平调节,并与细胞内参与能量和转录调节的相关信号分子相互作用,调节毛乳头细胞的凝集性生长状态.; 宋志强孙丽华郝飞; 关键词：毛乳头细胞双杂交系统技术

人白细胞介素24蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及其自激活检测: 2011年; 构建人白细胞介素24蛋白酵母双杂交诱饵载体,并检测其自激活作用。采用PCR技术特异性扩增人白细胞介素24基因IL-24,将其克隆入酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7中,通过PCR扩增、限制性酶切鉴定及序列测定,获得质粒pGBKT7-IL-24。采用PEG/L iAc法将其转入酵母AH109中,经表型筛选检测其自激活作用,同时利用对照质粒组筛选组氨酸(H is)本底表达抑制剂3-AT的合适工作浓度。结果获得了无自激活作用的诱饵载体pGBKT7-IL-24。确定了组氨酸(H is)本底表达抑制剂3-AT的最佳工作浓度。结论:诱饵质粒pGBKT7-IL-24可以用于酵母双杂交实验,为进一步运用酵母双杂交技术在人类组织cDNA文库中筛选与之相互作用的蛋白奠定了基础。; 黄晓萍郭建军范汉东杨一兵; 关键词：白细胞介素24 双杂交系统技术自激活作用

中国人群中少见β地中海贫血家系的分子遗传学特征分析被引量：1: 2011年; 目的探讨在中国人群中发现的1个少见β地中海贫血家系的分子遗传学特征.方法采用标准的血液学分析技术检测先证者及家系成员红细胞参数,包括RBC、Hb、MCV、MCH、MCHC和RDW,进行表型诊断.利用SPIFE快速自动电泳分析系统检测其血红蛋白组分Hb A、Hb A2和Hb F.采用RDB技术检测β地中海贫血基因突变,并进一步进行克隆测序及家系分析,明确突变位点.结果先证者及其父亲红细胞参数呈典型的小细胞低色素改变,MCV和MCH均降低,MCV分别为79.1 fl及63.1 fl,MCH为19.9 pg及20.9 pg;而先证者母亲的MCV及MCH均正常.先证者及其父亲Hb A2增加,分别为5.66%及5.60%,提示其为轻型β地中海贫血基因携带者.进一步的基因分析表明,先证者在一个β珠蛋白基因同时发生CD41/42（-TTCT）和转录区＋40～＋43缺失突变,诊断为β41/42、CAP/βA基因型的轻型地中海贫血患儿,其父母基因型分别为β41/42、CAP/βA 和βA/βA.结论先证者在一个β珠蛋白基因同时发生CD41/42（-TTCT）和转录区＋40～＋43缺失突变,β41/42、CAP/βA基因型的发现丰富了中国人群β珠蛋白基因突变研究数据。; 黄革黄小穗罗宪玲蒋文玲李运雄陈冬; 关键词：Β地中海贫血系谱珠蛋白类双杂交系统技术

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