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粉尘螨过敏原Der f 35的克隆表达及免疫学鉴定
2021年
粉尘螨是诱导过敏性疾病的重要变应原,可诱发Ⅰ型变态反应,对其免疫原性的鉴定是研究过敏性鼻炎等过敏性疾病的基础.首次对粉尘螨过敏原基因Der f 35进行克隆表达、纯化及免疫原性鉴定,提取粉尘螨总核糖核酸(ribonucleic acid,RNA),根据已知基因序列(GenBank:LC175222.1)设计引物进行反转录聚合酶链式反应扩增,经Bam H I和Xho I双酶切,连接构建pET-32a-Der f 35载体,并克隆至大肠杆菌TOP 10菌株,取1 mL克隆菌液进行测序.使用试剂盒提取高纯度质粒转至感受态细胞Rosetta(DE3)中进行诱导、表达纯化及免疫学鉴定,并进行同源性比对分析、进化树构建及二级结构预测.克隆和表达结果显示,Der f 35基因的片段长约436个碱基对(base pair,bp);重组蛋白Der f 35相对分子质量约为30 ku(1 u=1 D),与预期结果相符.蛋白质印迹法结果证明,Der f 35与尘螨过敏性疾病患者的血清结合有明显的反应原性.生物信息进化树结果显示,粉尘螨与屋尘螨、热带无爪螨、害嗜鳞螨、绵羊痒螨和免耳痒螨亲缘关系较近,二级结构预测显示Der f 35的氨基酸序列由2个α螺旋、6个β折叠、2个β转角和10个无规则卷曲片段组成.研究结果可为尘螨过敏性疾病的诊断与治疗提供理论依据.
陈扬陈献雄欧阳春艳钟永浩刘晓宇
关键词:生物信息学免疫学粉尘螨克隆表达
腰果主要过敏原Ana o 2原核表达及免疫学鉴定
2020年
目的构建Ana o 2重组表达质粒,原核表达重组蛋白并评价其免疫活性。方法将Ana o 2基因构建到p ET-28a(+)载体中,测序正确的重组质粒转化Rosetta(DE3)感受态细胞,诱导表达目的蛋白并进行质谱鉴定。利用腰果过敏阳性血清,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)和蛋白质免疫印记(Western blot)法评价重组Ana o 2的免疫活性。结果重组蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)表明分子量为54 k D,与理论值相符,经质谱鉴定为Ana o 2。ELISA结果显示,用重组Ana o 2检测腰果过敏阳性血清与阴性血清特异性Ig E抗体(s Ig E)水平差异有统计意义(t=2.44,P<0.05)。Western blot结果表明,重组Ana o 2与腰果过敏患者血清反应性良好。结论利用原核系统表达了Ana o 2,并且重组Ana o 2与腰果过敏患者血清具有良好的反应性。
康晨闫娟娟姜琛张嘉懿谢万珍毕宏晨李会强
关键词:ANAO重组蛋白特异性IGE抗体
粉尘螨过敏原Der f 32的克隆、表达、免疫学鉴定及其对树突状细胞的调节作用研究被引量:2
2019年
目的克隆、表达粉尘螨Der f 32蛋白,并鉴定免疫原性及其对树突状细胞(DC)的调节作用。方法合成粉尘螨过敏原Der f 32基因,与pET-24a(+)载体连接,转入大肠埃希菌BL21诱导表达,经亲和层析法纯化后,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白表达情况,蛋白质印迹(Western blotting)、临床皮肤点刺实验检测重组蛋白的免疫原性。将重组蛋白Der f 32与小鼠来源的DC2.4共培养24 h,设阳性对照组(加等量重组蛋白Der f 1)和阴性对照组(加等量PBS),流式细胞术检测细胞表面共刺激分子(CD40、 CD83和CD80)的表达。将重组蛋白稀释为10、 20、 30、 40、 50、 60μg/ml等不同浓度,分别与DC2.4共培养48 h后, Western blotting分析T细胞免疫球蛋白及黏蛋白域蛋白4 (TIM4)的表达情况。结果SDS-PAGE结果显示,重组蛋白Der f 32相对分子质量(Mr)约35 000。临床皮肤点刺实验表明, 42位尘螨过敏患者中有6例对重组蛋白Der f 32过敏,阳性率为14.2%。Western blotting结果显示,重组蛋白Der f 32能与皮试阳性患者血清IgE抗体特异性结合。流式细胞术检测结果显示,重组蛋白Der f 32与DC2.4共培养后, CD40、 CD83、 CD80的表达水平分别为24.5%、 9.6%和24.6%,高于阴性对照组(11.9%、 3.1%和15.6%)(P <0.01),低于阳性对照组(38.2%、 15.0%和39.1%)(P <0.05)。Western blotting检测结果显示, TIM4的表达量随重组蛋白Der f 32浓度的升高逐渐增加,且在Der f 32浓度为50μg/ml时, TIM4的表达量达到最高, TIM4相对灰度值为1.112。结论获得了具有较强免疫原性的粉尘螨新过敏原Der f 32,该蛋白能促进DC表面分子和TIM4的表达。
江贝肖小军欧阳春艳罗新萍孙宝清李靖刘志刚
关键词:粉尘螨F免疫原性树突状细胞
华支睾吸虫NOSIP基因的克隆表达及免疫学鉴定被引量:1
2019年
目的对华支睾吸虫一氧化氮合酶相互作用蛋白(CsNOSIP)进行克隆和原核表达,初步了解其重组产物的免疫学功能。 方法从华支睾吸虫基因文库中获得CsNOSIP的全长cDNA并克隆至原核表达质粒pET-30a(+)中,诱导表达后用亲和层析柱进行纯化,用纯化的rCsNOSIP及rCsNOSIP蛋白免疫BALB/c小鼠以获得rCsNOSIP免疫血清,采用Western blot鉴定重组蛋白CsNOSIP的表达及其反应原性;采用ELISA检测rCsNOSIP免疫小鼠血清特异性抗体亚类水平。 结果CsNOSIP基因的开放阅读框(ORF)包含867bp,编码288个氨基酸,PCR、双酶切及DNA测序表明pET-30a(+)-CsNOSIP重组质粒构建成功。SDS-PAGE检测目的蛋白在大肠埃希菌BL21/DE3中获得高效表达,表达产物相对分子质量为35×103;经亲和层析法获得高纯度的重组蛋白,该蛋白可被His单抗、CsNOSIP免疫小鼠血清、感染华支睾吸虫小鼠血清及ESP免疫血清识别,重组蛋白免疫血清能识别CsESP;ELISA检测显示rCsNOSIP免疫小鼠血清特异抗体滴度为1∶25 600,以IgG1水平较高。 结论CsNOSIP可在原核表达系统中呈现高效可溶性表达,且具有抗原性,是华支睾吸虫分泌排泄抗原(CsESP)之一,免疫小鼠后可获得高滴度的特异性抗体,抗体亚类以IgG1为主,为该蛋白的功能研究奠定了基础。
边萌汪肖云许青霞余新炳
关键词:华支睾吸虫基因克隆免疫原性
两种片形吸虫成虫抗原组分分析及其免疫学鉴定
2018年
目的应用SDS-PAGE对肝片形吸虫和巨片形吸虫成虫蛋白组分进行比较分析,并Western blot检测其特异性蛋白分子。方法分别收集肝片形吸虫和巨片形吸虫成虫,冰上研磨匀浆,提取上清蛋白,采用SDS-PAGE分析肝片形吸虫和巨片形吸虫差异蛋白组分;应用Western blot检测特异蛋白组分。结果虫体蛋白经SDS-PAGE后采用Gel Doc XR+凝胶成像系统对电泳图像进行高灵敏度分析,巨片形吸虫和肝片形吸虫成虫均有37条带,低灵敏分析显示肝片形吸虫成虫蛋白主要7条带,巨片形吸虫成虫蛋白主要有6条带,相对分子质量集中在10×10^3~70×10^3。Western blot检测巨片形吸虫有6条反应带,分别在150×10^3、100×10^3、75×10^3、50×10^3、34×10^3、23×10^3等位置;肝片形吸虫5条反应带,分别在55×10^3、37×10^3、34×10^3、23×10^3、15×10^3等位置。与血吸虫、囊虫、广州管圆线虫、旋毛虫的交叉反应蛋白为75×10^3、100×10^3、75×10^3组分(巨片形吸虫)和60.34×10^3组分(肝片形吸虫)。结论肝片形吸虫成虫与巨片形吸虫成蛋白组成有差异不明显,抗原特异的蛋白在23×10^3、15×10^3等位置,且22×10^3~24×10^3组分占比较大(在在肝片形吸虫占48.4%,巨片形吸虫占77.3%)。其特异的蛋白酶类有待经质谱分析后用于诊断抗原及疫苗研究,而15×10^3组分可能是肝片形吸虫特有的可区别于巨片形吸虫的蛋白。
陈凤艾琳陈家旭沈慧敏赵银娇刘榆华陈绍荣罗家军罗天鹏周晓农
关键词:片形吸虫抗原SDS-PAGEWESTERNBLOT
大肠杆菌肠毒素基因突变体在乳酸菌中的表达与免疫学鉴定被引量:1
2018年
目的构建表达大肠杆菌肠毒素基因突变体mlt63的乳酸菌工程菌株,为黏膜免疫佐剂研究建立重要基础。方法从前期构建的质粒p BV-mlt63中经PCR扩增mlt63基因,经双酶切将mlt63与质粒载体p NZ8110连接。用连接产物转化大肠杆菌MC1061菌株,从重组菌株中提取p NZ8110-mlt63,用于电转化Lactococcus lactis NZ3900菌株;经质粒双酶切和测序,鉴定重组菌株L.lactis NZ3900/p NZ8110-mlt63。采用nisin诱导重组乳酸菌表达m LT63,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果 mlt63 PCR扩增产物长度与预期相符;重组菌株鉴定结果显示L.lactis NZ3900/p NZ8110-mlt63构建正确;Western blot分析在重组菌株中检出2条mlt63表达的蛋白带,分子量分别为10 k D和40 k D。结论本研究首次将mlt63基因克隆至乳酸乳球菌中,并表达出具有抗原活性的蛋白,鉴于目前亟需安全有效的黏膜免疫佐剂,本研究发现将对该领域研究产生重要影响,对胃肠感染性疾病口服疫苗研究具有促进作用。
王琛尹光辉尹光辉李健李健张荣光
关键词:乳酸乳球菌肠毒素基因重组免疫佐剂
家蚕过敏原Profilin的表达、纯化、免疫学鉴定及其生物信息分析被引量:1
2017年
目的:克隆表达家蚕(Bombyx mori)Profilin蛋白,鉴定免疫原性并进行B细胞抗原表位预测和构建分子进化树。方法:从NCBI上获取家蚕Profilin蛋白的基因序列,合成该基因并构建到pet-28a表达载体上,重组质粒转化至E.coli BL21,IPTG诱导基因表达,通过亲和层析获取高纯度蛋白;用Western blot方法对重组蛋白进行过敏原性鉴定;通过DNAStar软件分析其潜在的B细胞抗原表位;应用MEGA5.05进行序列比对,并构建分子进化树。结果:成功表达出重组蛋白,且重组蛋白与家蚕过敏患者血清有一定的Ig E结合。结论:成功克隆表达出具有免疫原性的Profilin蛋白,并成功预测出其B细胞抗原表位和构建出分子进化树。
胡维梁志林王良录钟慧玲刘志刚
关键词:家蚕
家蚕蚕蛹基因LOC101743840的原核表达、免疫学鉴定及生物信息分析被引量:3
2017年
目的原核表达家蚕蚕蛹LOC101743840(以下简称LOC)基因,鉴定LOC蛋白的免疫学特性,并进行生物信息分析。方法将合成的家蚕蚕蛹LOC基因(gi|512917985)连接至克隆载体p MD18-T,用限制性内切酶Xho I和Bam H I分别对p MD18-T-LOC阳性质粒与原核表达载体p ET-28a双酶切,构建重组表达质粒p ET-28a-LOC并转化到E.coli BL21(DE3)中进行表达(经IPTG诱导);用Western blot鉴定重组LOC蛋白的免疫活性;用Clustalw2和MEGA5工具包分析LOC的基因;用Prot Param Tools预测LOC蛋白的理化性质;用PSIPRED和SWISS-MODEL预测其蛋白质结构。用IEDB、Preprod和DNAStar预测其细胞抗原表位。结果成功表达了家蚕蚕蛹LOC基因,其开放阅读框768 bp,编码255组氨基酸;由E.coli BL21(DE3)原核表达的重组LOC蛋白为可溶性,分子量约33 k D;Western bolt结果显示重组LOC蛋白可特异性结合家蚕蚕蛹过敏患者血清中的特异性Ig E;家蚕蚕蛹LOC与脐橙螟LOC106139919(gi|913330692)蛋白的同源性为69%。系统进化树显示家蚕蚕蛹与美国白蛾亲缘关系比较近。理化性质预测结果显示LOC蛋白质不稳定。蛋白质结构预测结果显示LOC主要的结构为无规则卷曲。T细胞抗原表位预测得到8个肽段(9-17、79-87、93-102、104-115、124-132、152-160、223-231和244-251)。B细胞抗原表位预测得到个5肽段(34-49、59-74、127-142、202-217和213-228)。结论成功表达了家蚕蚕蛹LOC,并证实重组LOC蛋白具有良好的免疫活性,为进一步研究家蚕蚕蛹蛋白的结构成分、免疫学特性及理化性质提供了实验数据。
梁志林刘晓宇刘志刚陈献雄
关键词:原核表达免疫学鉴定生物信息学分析
虾过敏原Troponin C(Pen m6)的克隆表达、免疫学鉴定及生物信息分析被引量:1
2017年
目的对斑节对虾(Penaeus monodon)第6组过敏原(Pen m6),肌钙蛋白C(Troponin C)进行克隆表达、免疫学鉴定并研究其生物意义。方法提取斑节对虾总RNA;根据Gen Bank:HM034316.1设计引物及构建表达载体PET-24a-Pen m6;转化至大肠杆菌BL21(DE3)进行表达;纯化后的重组Pen m6用Western bolt来鉴定免疫学特性;用生物信息相关工具对Pen m6进行同源性分析,并预测其蛋白质的结构和功能。结果克隆出斑节对虾Pen m6基因开放阅读框453 bp,编码150个氨基酸。重组Pen m6蛋白呈可溶性,分子量约35kDa,能够与斑节对虾过敏患者血清IgE结合。斑节对虾与凡纳滨对虾亲缘关系比较近,其中斑节对虾Pen m6蛋白与凡纳滨对虾Troponin C1(gb|AET36896.1|)同源性为98%。理化性质预测Pen m6蛋白质不稳定。蛋白质结构预测结果显示Pen m6的结构主要以α螺旋组成。T细胞抗原表位预测得到4个肽序列(15~23、35~43、91~99、112~120)。B细胞抗原表位预测得到4个肽序列(7~16、21~30、28~37、58~67)。结论克隆的重组斑节对虾Pen m6蛋白具有良好的免疫原性,为进一步研究斑节对虾过敏原的结构成分及其理化性质奠定理论基础。
梁志林孙宝清叶小英郭丹叶佩莹孙雯阳刘志刚陈同强
关键词:斑节对虾TROPONIN免疫学特性
家蚕MBP-Bmlp7蛋白的克隆表达及免疫学鉴定被引量:3
2017年
克隆表达家蚕蚕蛹30 kD(1 kD=1 u)脂蛋白家族成员Bmlp7(Bombyx mori lipoprotein 7)的融合蛋白,鉴定其致敏原性.合成Bmlp7的基因后连接至载体质粒p MAL-C5e上,在大肠杆菌BL21中诱导表达出麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein,MBP)-Bmlp7,纯化后,利用Western blot鉴定MBP-Bmlp7融合蛋白与家蚕过敏患者血清中特异性免疫球蛋白E(immunoglobulins E,Ig E)的结合能力.结果显示,纯化得到了纯度较高的MBP-Bmlp7融合蛋白,且该融合蛋白能够与家蚕过敏患者血清特异性IgE结合,说明Bmlp7是家蚕中一种潜在的致敏原.
曹会蔡德丰杨平常刘志刚夏立新
关键词:免疫学家蚕表达纯化免疫印迹

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刘志刚
作品数:715被引量:1,947H指数:20
供职机构:中国水产科学研究院珠江水产研究所
研究主题:变应原 粉尘螨 纯化 尼罗罗非鱼 无乳链球菌
邬玉兰
作品数:48被引量:105H指数:6
供职机构:深圳大学
研究主题:纯化 免疫学鉴定 克隆表达 粉尘螨 变应原
严杰
作品数:357被引量:1,059H指数:14
供职机构:杭州医学院
研究主题:问号钩端螺旋体 钩端螺旋体 幽门螺杆菌 原核表达系统 外膜蛋白
刘晓宇
作品数:75被引量:184H指数:8
供职机构:深圳大学
研究主题:粉尘螨 纯化 屋尘螨 生物信息学分析 克隆表达
仲人前
作品数:681被引量:2,334H指数:18
供职机构:第二军医大学长征医院
研究主题:原发性胆汁性肝硬化 原发性胆汁性 肝硬化患者 自身抗体 颗粒溶素