粉尘螨是诱导过敏性疾病的重要变应原,可诱发Ⅰ型变态反应,对其免疫原性的鉴定是研究过敏性鼻炎等过敏性疾病的基础.首次对粉尘螨过敏原基因Der f 35进行克隆表达、纯化及免疫原性鉴定,提取粉尘螨总核糖核酸(ribonucleic acid,RNA),根据已知基因序列(GenBank:LC175222.1)设计引物进行反转录聚合酶链式反应扩增,经Bam H I和Xho I双酶切,连接构建pET-32a-Der f 35载体,并克隆至大肠杆菌TOP 10菌株,取1 mL克隆菌液进行测序.使用试剂盒提取高纯度质粒转至感受态细胞Rosetta(DE3)中进行诱导、表达纯化及免疫学鉴定,并进行同源性比对分析、进化树构建及二级结构预测.克隆和表达结果显示,Der f 35基因的片段长约436个碱基对(base pair,bp);重组蛋白Der f 35相对分子质量约为30 ku(1 u=1 D),与预期结果相符.蛋白质印迹法结果证明,Der f 35与尘螨过敏性疾病患者的血清结合有明显的反应原性.生物信息学进化树结果显示,粉尘螨与屋尘螨、热带无爪螨、害嗜鳞螨、绵羊痒螨和免耳痒螨亲缘关系较近,二级结构预测显示Der f 35的氨基酸序列由2个α螺旋、6个β折叠、2个β转角和10个无规则卷曲片段组成.研究结果可为尘螨过敏性疾病的诊断与治疗提供理论依据.
目的构建Ana o 2重组表达质粒,原核表达重组蛋白并评价其免疫活性。方法将Ana o 2基因构建到p ET-28a(+)载体中,测序正确的重组质粒转化Rosetta(DE3)感受态细胞,诱导表达目的蛋白并进行质谱鉴定。利用腰果过敏阳性血清,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)和蛋白质免疫印记(Western blot)法评价重组Ana o 2的免疫活性。结果重组蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)表明分子量为54 k D,与理论值相符,经质谱鉴定为Ana o 2。ELISA结果显示,用重组Ana o 2检测腰果过敏阳性血清与阴性血清特异性Ig E抗体(s Ig E)水平差异有统计学意义(t=2.44,P<0.05)。Western blot结果表明,重组Ana o 2与腰果过敏患者血清反应性良好。结论利用原核系统表达了Ana o 2,并且重组Ana o 2与腰果过敏患者血清具有良好的反应性。
目的克隆、表达粉尘螨Der f 32蛋白,并鉴定其免疫原性及其对树突状细胞(DC)的调节作用。方法合成粉尘螨过敏原Der f 32基因,与pET-24a(+)载体连接,转入大肠埃希菌BL21诱导表达,经亲和层析法纯化后,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白表达情况,蛋白质印迹(Western blotting)、临床皮肤点刺实验检测重组蛋白的免疫原性。将重组蛋白Der f 32与小鼠来源的DC2.4共培养24 h,设阳性对照组(加等量重组蛋白Der f 1)和阴性对照组(加等量PBS),流式细胞术检测细胞表面共刺激分子(CD40、 CD83和CD80)的表达。将重组蛋白稀释为10、 20、 30、 40、 50、 60μg/ml等不同浓度,分别与DC2.4共培养48 h后, Western blotting分析T细胞免疫球蛋白及黏蛋白域蛋白4 (TIM4)的表达情况。结果SDS-PAGE结果显示,重组蛋白Der f 32相对分子质量(Mr)约35 000。临床皮肤点刺实验表明, 42位尘螨过敏患者中有6例对重组蛋白Der f 32过敏,阳性率为14.2%。Western blotting结果显示,重组蛋白Der f 32能与皮试阳性患者血清IgE抗体特异性结合。流式细胞术检测结果显示,重组蛋白Der f 32与DC2.4共培养后, CD40、 CD83、 CD80的表达水平分别为24.5%、 9.6%和24.6%,高于阴性对照组(11.9%、 3.1%和15.6%)(P <0.01),低于阳性对照组(38.2%、 15.0%和39.1%)(P <0.05)。Western blotting检测结果显示, TIM4的表达量随重组蛋白Der f 32浓度的升高逐渐增加,且在Der f 32浓度为50μg/ml时, TIM4的表达量达到最高, TIM4相对灰度值为1.112。结论获得了具有较强免疫原性的粉尘螨新过敏原Der f 32,该蛋白能促进DC表面分子和TIM4的表达。