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一种通过结合低氧反应元件控制缺氧反应基因表达的染色质肽
本发明公开了一种染色质肽,它实质上是人体自身细胞缺氧反应基因中低氧反应元件的转录因子所降解而成的寡聚肽以及这些寡聚肽的生物学仿生分子。恶性肿瘤细胞内低氧反应元件的转录因子启动了细胞内的无氧呼吸、细胞增殖、血管形成和发炎,...
谭樵夫
文献传递
低氧诱导因子-1/低氧反应元件通路在心肌保护中的研究进展被引量:2
2016年
背景低氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)是目前公认的在缺氧状态下发挥重要作用的核转录因子,其活化后可介导低氧反应保护作用,在一定程度上能够减轻心肌的缺血/再灌注损伤(ischemic reperfusion injury,I/RI).目的探究HIF-1/低氧反应元件(hypoxiaresponse element,HRE)通路是如何被激活并发挥心肌保护的作用。内容从HIF—I的概述、调节以及HIF-1/HRE通路的激活机制及其心肌保护作用方面进行综述,并以HIF-1为靶点探究后处理的心肌保护作用的机制,对其在心肌保护作用中与其他关键性的转录因子之间的内在联系作一简要综述。趋向后处理能否激活HIF-1/HRE通路诱导红细胞生成素(erythropoietin,EPO)、血红素加氧酶1(hemeoxygenasel,HO-1)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等保护性蛋白的表达,以减轻心肌I/RI,尚需进一步探讨。
周雯静王海英
关键词:低氧诱导因子-1低氧反应元件心肌
低氧反应元件荧光素酶报告载体的构建及鉴定
2015年
【目的】构建低氧反应元件(hypoxic response element,HRE)荧光素酶报告载体,以检测和分析细胞内低氧诱导因子(hypoxia inducible factor,HIF-1)表达。【方法】化学合成HRE的核心启动子序列(6×HRE),将其定向克隆入p GL3-BASIC,经PCR、酶切和测序鉴定,获得p GL3-HRE荧光素酶报告载体;然后以p GL3-HRE和β-gal DNA共转染MG63细胞,通过物理和化学低氧来检测其活性,并western blotting分析转染细胞HIF-1表达水平。【结果】获得了p GL3-HRE荧光素酶报告载体,PCR、酶切和测序鉴定均与预期一致;物理低氧(1%O2)和化学低氧(不同浓度Co Cl2)均可诱导转染MG63细胞荧光素酶表达水平的升高(P<0.05),其中以Co Cl(3002μmol/L)组最为显著,western blotting结果也显示Co Cl2(300μmol/L)组HIF-1表达水平更为显著(P<0.05),与荧光素酶表达趋势一致。【结论】成功构建了HRE荧光素酶报告载体,为进一步研究HIF-1的表达调控作用及筛选抗低氧药物提供了工具。
屈野陈晓杨静郭小芹李玲王越
关键词:低氧诱导因子低氧反应元件荧光素酶报告基因
低氧反应元件介导的低氧调控的神经营养因子-3表达上调减少低氧诱导的PC12细胞凋亡
2015年
目的在体外培养的PC12细胞中观察低氧反应元件(HRE)介导的神经营养因子-3(NT-3)对低氧反应性表达上调及其对低氧诱导的PC12细胞凋亡的影响。方法用分子生物学方法将5拷贝HRE(5HRE)和NT-3克隆入反转录病毒载体中构建HRE介导的低氧调控表达载体,并转导入PC12细胞,ELISA法检测NT-3的表达和分泌,TUNEL法检测细胞凋亡,Western blotting检测p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)和Caspase-3激活情况。结果成功构建重组反转录病毒载体,并将外源基因转导入PC12细胞中(PC12-NT3-EGFP、PC12-5HRE-NT3-EGFP和PC12-5HRE-EGFP)。在正常条件培养下,PC12-5HRE-NT3-EGFP细胞中NT-3表达水平较低,但在低氧处理后,NT-3表达明显升高(n=3,P<0.05)。在低氧处理后,与PC12细胞组相比,PC12-5HRE-NT3-EGFP组中细胞凋亡明显减少(n=3,P<0.05),且p38 MAPK和Caspase-3磷酸化也明显减少(n=3,P<0.05)。结论在PC12细胞中HRE介导的低氧反应性调控NT-3的表达上调可以对PC12细胞产生保护作用。
张军峰史利利张力赵朝华杨蓬勃张建水刘勇徐曦
关键词:低氧反应元件神经营养因子-3低氧
低氧反应元件介导的Bcl-2-shRNA对缺氧诱导抗凋亡肺血管内皮细胞的调控作用被引量:1
2015年
目的探讨低氧反应元件(HRE)介导的Bcl-2基因沉默对缺氧诱导抗凋亡肺微血管内皮细胞的影响。方法设计针对Bcl-2的siRNA序列,构建含Bcl-2-shRNA和HRE的表达载体并进行慢病毒包装,重组病毒感染肺微血管内皮细胞,分别在常氧(21%)或低氧(5%)条件下培养;96 h后通过荧光标记物确认感染效率,Western blotting检测转染后细胞内Bcl-2蛋白表达的变化,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果 Bcl-2基因沉默明显下调细胞内Bcl-2 mRNA和蛋白的表达;HRE启动子仅在低氧环境中活性显著增强;重组慢病毒感染肺微血管内皮细胞后96 h时的转染效率约为90%,细胞内Bcl-2蛋白表达下调,细胞凋亡增加;在低氧环境中,受HRE的调控,Lv-HRE-Bcl-2-shRNA组细胞凋亡率显著增高。结论低氧条件下,HRE作为氧敏感调控开关,可进一步增强Bcl-2-shRNA的作用,诱导肺血管内皮细胞凋亡,这将为肺动脉高压的血管重塑提供潜在的治疗靶标。
姜桢曹永梅曾真顾玉春季莹莹赵宇鹏李颖川
关键词:BCL-2低氧反应元件
白蛋白过负荷对肾小管上皮细胞低氧诱导因子/低氧反应元件转录活性的影响
2014年
目的探讨白蛋白过负荷对大鼠肾小管上皮(NRK-52E)细胞低氧诱导因子/低氧反应元件(HIF/HRE)转录活性的影响。方法应用低氧反应元件报告基因质粒检测HIF/HRE转录活性。pGL3-Epo—HRE.Luc报告基因质粒转染的NRK-52E细胞在含去脂小牛血清白蛋白(BSA)0、5、10、20mg/ml的培养基中分别孵育24、48、72h,双荧光素酶法检测各组细胞相对荧光强度表达,Western印迹法检测相对应条件下HIF—lot蛋白的表达。结果10mg/mlBSA作用48h组细胞HIF/HRE转录活性显著高于空白对照组[(2.59±0.35)比(1.03±0.09),P〈0.011。20mg/mlBSA作用48h组NRK-52E细胞HIF—lot蛋白表达显著高于空白对照组[(0.052±0.010)比(0.014±0.003),P〈0.011。结论BSA可增强肾小管上皮细胞的HIF/HRE转录活性。
梁献慧王沛刘章锁乔颖进张宛哲王凯陆晓青
关键词:白蛋白类低氧诱导因子转录
低氧反应元件操控血管内皮细胞生长因子表达协同骨骼肌成肌细胞移植治疗急性心肌梗死被引量:1
2012年
目的观察pcDNA3.1/血管内皮细胞生长因子(VEGF)及pEGFP—C3-9低氧反应元件(HRE)-MV-VEGF的骨骼肌成肌细胞移植对急性心肌梗死的治疗作用。方法建立急性心肌梗死模型,分别将无血清培养基(A组)、未转染骨骼肌成肌细胞(B组)、转染pcDNA3.1/VEGF的成肌细胞(C组)以及转染pEGFP-C3-9HRE—CMV—VEGF的成肌细胞(D组)注射到梗死区,4周后检测死亡率、心脏功能、心肌梗死面积、移植细胞形态、梗死区VEGF的表达及毛细血管密度的变化。结果术后4周死亡率C(10.0%)、D(13.3%)组与B组(26.7%)差异有统计学意义(P〈0.01)。C组(32.9±1.4)%、D(33.1±1.4)%组心脏功能指标及心肌梗死面积均好于A组(44.54-1.7)%、B组(38.2±1.5)%(P〈0.01)。B、C、D组染色结果可见新生骨骼肌样组织。C、D组VEGF灰度值均明显低于A、B组(P〈0.01)。C、D组毛细血管数目明显多于A、B组(P〈0.01)。结论转基因骨骼肌成肌细胞移植后对急性心肌梗死的治疗作用明显优于对照组及未转染成肌细胞,移植后转基因成肌细胞分泌VEGF明显增强,可以促进血管发生与形成,从而有效的建立一种有助于移植细胞增殖、分化和形成功能的微环境,证明了转基因骨骼肌成肌细胞移植治疗心肌梗死的可行性。
刘成硅徐磊张凯伦夏家红洪昊
关键词:低氧反应元件细胞移植急性心肌梗死
构建人工合成的微小低氧反应元件可调控的AAV载体被引量:1
2011年
目的:人工合成微小HER,将其插入到AAV重组质粒的CMV启动子上游,采用磷酸钙沉淀法包装低氧反应元件调控的AAV重组病毒,为缺血性心脑血管病的基因治疗制备可以控制表达的AAV载体。方法:人工合成具有4次重复串联的低氧诱导因子结合位点(HIF-binding site,HBS)A/GCGTG(4×HBS)的36 bp核酸片段和插入到CMV启动子TATA Box上游的间隔区35 bp的核酸序列,并运用PCR方法扩增。测序正确后,通过常规分子生物学重组方法,将原AAV载体质粒中CMV启动子替换成为含有最小人工合成HRE的CMV启动子,重组构建了低氧反应元件调控的AAV载体。并在该载体CMV启动子下游的多克隆位点插入具有6×His标签的NT4-6His-PR39融合肽序列。磷酸钙沉淀法包装表达NT4-6His-PR39融合肽序列的重组AAV。重组病毒感染人宫颈癌细胞(HeLa),化学性低氧培养,使用免疫组织化学观察低氧条件的诱导表达作用。结果:基因测序结果和酶切结果表明,我们已经把人工合成的HRE,以正确的间隔插入到CMV启动子的上游,成功地构建了HRE调控的AAV重组载体。重组病毒感染的细胞在常氧和低氧诱导表达的结果表明,在启动子上游插入人工合成的微小HRE能够有效调控重组腺相关病毒的表达。结论:使用PCR方法可以将人工合成的HER插入缺乏内切酶识别点的CMV启动子上游,可以制备低氧调控的真核表达载体。人工合成的微小HRE能够有效的调控CMV启动子控制的下游基因表达。该载体的成功制备在缺血性心脑血管病的预防和治疗中具有重要的理论和使用价值。
聂小维孙立军郝跃文杨广笑王全颖
关键词:重组腺伴随病毒低氧诱导
低氧反应元件调控缺血心肌转染hVEGF_(165)基因表达对新生血管的影响被引量:1
2009年
目的探讨动物整体水平下低氧反应元件(HRE)调控缺血心肌转染hVEGF165基因表达对促生血管的影响。方法建立兔心肌缺血动物模型,实验分为转基因组、缺血对照组、载体对照组和假手术组。取缺血区心肌组织,检测心肌组织HIF-1α和hVEGF165表达,应用CD31及α-SMA免疫组化染色测定缺血心肌新生血管密度变化。结果心肌缺血早期,伴随内源性HIF-1α表达增加,hVEGF165mRNA及蛋白表达相继升高,缺血4~6周至高峰(P〈0.01),缺血12周,hVEGF165表达下调至缺血前水平。缺血12周,转基因组CD31(+)血管密度显著高于缺血对照组(P〈0.01);但是,与缺血前相比,缺血12周,转基因组α-SMA(+)血管密度显著低于缺血前水平(P〈0.01)。结论HIF-1α-HRE对缺血心肌转染hVEGF165表达发挥了有效的正相调控作用,有效地促进缺血心肌毛细血管生成。但hVEGF165作为促血管生成早期调节因子,其促生血管的结构尚不完整。
董红燕王强张中明袁延亮张宜乾徐夏红
关键词:低氧反应元件基因调控心肌细胞
低氧反应元件调控的腺病毒-胸苷激酶对肝癌细胞HepG2的体外杀伤作用被引量:1
2009年
目的:构建携带受低氧反应元件(HRE)调控的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因的重组腺病毒载体,探讨该重组腺病毒对体外培养的肝癌细胞HepG2的特异性杀伤活性。方法:采用Ad Easysystem构建携带受HRE调控TK基因表达的腺病毒Ad-HRE-TK,体外感染肝癌细胞系HepG2后分别在正常和低氧条件下培养。分别采用反转录-聚合酶链式扩增(RT-PCR)及蛋白质印迹(Western blotting)技术检5测TKmRNA及蛋白表达情况,并用不同浓度的丙氧鸟苷(GCV)处理后以MTT法检测细胞的增殖情况。结果:RT-PCR及Western blotting结果显示,仅转染重组腺病毒Ad-HRE-TK并在低氧条件下培养的HepG2细胞特异性表达TK基因及蛋白。HepG2细胞感染Ad-HRE-TK后,在低氧培养条件下对GCV的敏感性明显增加,在感染复数(MOI)为100并用50mg/LGCV处理时,则有95%以上HepG2细胞被杀死。而正常氧浓度下培养组,未能观察到GCV的杀伤作用。结论:低氧条件下,HRE可特异性地促进HSV-TK基因的表达,从而诱导GCV的毒性作用。
王小忠彭启全彭云恒廖文鹏
关键词:低氧反应元件单纯疱疹病毒胸苷激酶腺病毒载体

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张中明
作品数:122被引量:215H指数:7
供职机构:徐州医学院附属医院
研究主题:缺血预处理 未成熟心肌 心肌保护 低氧反应元件 冬眠心肌
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