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晚期糖基化终末产物对视网膜色素上皮细胞铁死亡的诱导作用
2025年
目的探讨晚期糖基化终末产物(AGEs)对体外培养的视网膜色素上皮(ARPE-19)细胞铁死亡的影响。方法ARPE-19细胞系在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养并传代,选取第3~6代的细胞进行研究。分别在培养板中加入0、50、100、200、400μg/ml AGEs,培养48 h,采用细胞计数试剂盒8检测各组细胞活性。选取200μg/ml AGEs培养细胞48 h,采用脂质过氧化试剂盒(Bodipy 581/591 C11)联合流式细胞术测定细胞脂质过氧化水平;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot检测铁死亡标志蛋白溶质载体家族7成员11(SLC7A11)及谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的相对表达水平;采用透射电子显微镜观察各组细胞线粒体形态。结果ARPE-19细胞活性随着AGEs浓度的增加逐渐下降,0、50、100、200、400μg/ml AGEs组细胞活性总体比较差异有统计学意义(F=6.21,P<0.01),200、400μg/ml AGEs组ARPE-19细胞活性均低于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。流式细胞仪检测结果显示,AGEs组荧光强度为622.0±11.3,明显高于对照组的487.7±12.8,差异有统计学意义(t=6.809,P=0.002)。qRT-PCR检测结果显示,AGEs组细胞中SLC7A11、GPX4 mRNA和蛋白相对表达量明显低于对照组,差异均有统计学意义(mRNA:t=3.72、7.14,均P<0.05;蛋白:t=6.20、5.15,均P<0.05)。透射电子显微镜观察结果显示,AGEs组中线粒体皱缩,体积较对照组明显缩小,线粒体脊较对照组减少,线粒体膜密度较对照组增加。结论AGEs能诱导体外培养的ARPE-19细胞发生铁死亡。
童俊解正高雷黄依包延波黄振平
关键词:晚期糖基化终末产物人视网膜色素上皮细胞糖尿病视网膜病变
丹芪化瘀方对光诱导的视网膜色素上皮细胞氧化应激的影响
2025年
目的观察丹芪化瘀方对光诱导的视网膜色素上皮(RPE)细胞氧化应激的影响,探讨其保护视网膜的作用机制。方法2组大鼠分别以31.05 g/kg丹芪化瘀方中药颗粒水溶液和等体积蒸馏水灌胃,制备含药血清和空白血清。常规培养的RPE细胞使用白色发光二极管(LED)冷光灯于(7,500±200)LUX光照强度的下直落式照射12 h,建立RPE细胞光损伤模型,随机分为模型组(MG)、低剂量丹芪化瘀方组(L-DQHY)、中剂量丹芪化瘀方组(M-DQHY)、高剂量丹芪化瘀方组(H-DQHY),另将采用锡纸遮光的对照细胞设为对照组(CG)。CG组细胞不加任何试剂,MG组细胞加入大鼠空白血清,L-DQHY组、M-DQHY组、HDQHY组细胞分别加入4%、8%、16%浓度的丹芪化瘀方大鼠血清,培养24 h。细胞计数试剂-8(CCK-8)法检测细胞活性,流式细胞仪检测活性氧(ROS)表达,实时荧光定量PCR(RTqPCR)法检测还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NOX4)mRNA表达,酶联免疫吸附法(ELISA)检测超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)表达水平。结果(1)细胞活性:MG组细胞活性低于CG组(t=13.592,P=0.000),M-DQHY组、H-DQHY组细胞活性高于MG组(tM-DQHY=3.910,P=0.001;tH-DQHY=9.028,P=0.000),差异均有统计学意义。(2)ROS:MG组ROS表达水平高于CG组(t=13.457,P=0.000),L-DQHY组、MDQHY组、H-DQHY组ROS表达水平低于MG组,(tL-DQHY=7.697、tM-DQHY=8.325、tH-DQHY=13.219,均P=0.000),差异均有统计学意义。(3)NOX4 mRNA:MG组NOX4 mRNA表达水平高于CG组(t=42.469,P=0.000),L-DQHY组、M-DQHY组、H-DQHY组NOX4 mRNA表达水平低于MG组(tL-DQHY=17.238、tM-DQHY=28.764、tH-DQHY=35.210,均P=0.000),差异均有统计学意义。(4)SOD、GSH-Px、MDA:MG组MDA表达水平高于CG组(t=50.375,P=0.000),SOD、GSH-Px表达水平低于CG组(tSOD=39.847、tGSH-Px=45.431,均P=0.000);L-DQHY组、M-DQHY组、H-DQHY组MDA表达水平低于MG组(tL-DQHY=13.821、tM-DQHY=20.223、tH-DQHY=40.067,均P=0.000),SOD、GSH-Px表达
周媛喻京生颜家朝秦裕辉朱定耀于奕李一枝柳葵
关键词:视网膜光损伤氧化应激NOX4
丹芪化瘀方含药血清对光损伤视网膜色素上皮细胞保护机制研究
2025年
目的:探讨丹芪化瘀方含药血清对LED冷光源致视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)光损伤的防治作用及最佳药物剂量,探寻其可能存在的保护机制。方法:应用健康的SD大鼠制备丹芪化瘀方空白血清和含药血清,将0%(空白血清)及5%、10%、15%、20%含药血清作用于ARPE-19细胞,每组设6个复孔。各组加入相应的药物于细胞恒温培养箱中培养24 h后采用CCK-8检测细胞活力,筛选最佳含药血清浓度进行后续实验。实验设置对照组、空白血清组、低剂量、中剂量、高剂量含药血清组培养,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测细胞中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、内皮素-1(ET-1)mRNA表达;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测一氧化氮合成酶(NOS)、一氧化氮(NO)、血管内皮生长因子(VEGF)含量;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测对照组、空白血清组、高剂量组iNOS的蛋白表达水平。结果:筛选出16%丹芪化瘀方含药血清作为后续实验干预浓度。与对照组比较,空白血清组iNOS、ET-1 mRNA表达及NOS、NO、VEGF含量均升高(P<0.001),eNOS mRNA表达降低(P<0.001);随着含药血清浓度的增加细胞中iNOS、ET-1 mRNA表达及NOS、NO、VEGF含量逐渐降低,eNOS mRNA表达增加(P<0.001),与低、中剂量组相比,高剂量组的iNOS、ET-1 mRNA表达及NOS、NO、VEGF含量显著降低(P<0.001或P<0.01或P<0.05),eNOS mRNA显著升高(P<0.001或P<0.05);空白血清组iNOS蛋白水平明显高于对照组,而16%含药血清的iNOS蛋白水平明显低于空白血清组(P<0.001)。结论:丹芪化瘀方含药血清可能通过抑制iNOS/NO途径减轻细胞损伤,上调eNOS表达,下调ET-1、VEGF的表达,抑制脉络膜新生血管形成并改善血-视网膜屏障功能,从而发挥保护作用。
周媛颜家朝秦裕辉喻京生朱定耀于奕李一枝柳葵
关键词:视网膜光损伤视网膜色素上皮血-视网膜屏障
缺氧和高糖对视网膜色素上皮细胞VEGF_(165)及VEGF_(165b)表达的影响
2025年
目的:通过研究体外培养的视网膜色素上皮细胞(RPE)在工模拟的缺氧和高糖环境中VEGF_(165)及VEGF_(165b)表达的情况,探讨VEGF_(165)、VEGF_(165b)在糖尿病视网膜病变(DR)发生发展中的作用及相互之间的关系。方法:正常接种并体外培养视网膜色素上皮细胞,150μmol/LCoCl2和25mmol/L葡萄糖分别模拟细胞缺氧和高糖环境,将接种细胞分为正常组、缺氧组、高糖组、联合组共4组。每组分别于12、24、36、48h提取RNA和蛋白,RT-PCR法和WesternBlot法检测四组RPE细胞VEGF_(165)、VEGF_(165b)的mRNA和蛋白相对表达量,比较缺氧和高糖环境下VEGF_(165)和VEGF_(165b)在视网膜色素上皮细胞的表达及关系。结果:⑴缺氧和高糖环境下RPE细胞分裂增殖受限,细胞活力降低。⑵VEGF_(165)及VEGF_(165b)mRNA和蛋白的表达情况:在缺氧模型建立后12h各组细胞间的表达差异无统计学意义,而24、36、48h时各组细胞的表达差异有统计学意义,其中VEGF_(165)mRNA和蛋白在缺氧组、高糖组、联合组的表达随时间变化而逐渐增加且均高于同一时间的正常组,而VEGF_(165b)mRNA和蛋白的表达则随时间变化而逐渐减少且均低于同一时间的正常组,差异均有统计学意义(P均<0.05)。⑶联合组的VEGF_(165)mRNA和蛋白表达较缺氧组、高糖组表达增加更多,缺氧组与高糖组比较只在24h时间点差异有统计学意义;而联合组的VEGF_(165b)mRNA和蛋白的表达较缺氧组、高糖组的表达降低更多,缺氧组与高糖组比较差异无统计学意义。结论:体外培养RPE细胞能够正常表达VEGF_(165b),缺氧和高糖在转录水平诱导VEGF_(165)mRNA和蛋白的表达上调,同时降低VEGF_(165b)mRNA和蛋白的表达量。将促血管生成的VEGF_(165)转换为抑制血管生成的VEGF_(165b)将有望成为DR的治疗新思路。
陆璐余锦强黄煜薇
关键词:糖尿病视网膜病变视网膜色素上皮细胞
一种视网膜色素上皮细胞的纯化、培养方法
本发明属于生物医药领域,具体涉及一种视网膜色素上皮细胞的纯化、培养方法。更具体地,本发明提供了ITGAV的特异性结合试剂在纯化和/或制备视网膜色素上皮细胞中的应用,通过ITGAV的特异性结合试剂纯化得到的细胞具有提升视网...
王少军杜璐郭静
一种视网膜色素上皮细胞的纯化、培养方法
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黄芪甲苷对视网膜色素上皮细胞线粒体氧化损伤的调控作用
2024年
目的探究黄芪甲苷对H_(2)O_(2)诱导视网膜上皮细胞(Retinal pigment epithelium,RPE)线粒体氧化损伤的调控作用。方法建立H_(2)O_(2)诱导RPEARPE-19和hTERT RPE-1氧化损伤模型,并加入不同剂量黄芪甲苷,用CCK-8法检测ARPE-19和hTERT RPE-1细胞增殖活性,用荧光探针标记法检测ARPE-19细胞活性氧(Reactive oxygen,ROS)和脂质过氧化水平,用化学显色法检测ARPE-19细胞内SOD、LDH和MDA水平,用JC-1标记法检测ARPE-19细胞线粒体膜电势,用Calcein AM荧光染色法检测ARPE-19线粒体通透性,用蛋白质免疫印迹实验检测ARPE-19细胞Nrf2表达及磷酸化水平。结果与对照组比较,H_(2)O_(2)模型组ARPE-19和hTERT RPE-1细胞增殖活性明显下降(P<0.05),细胞内ROS积累增加(P<0.05),脂质过氧化水平升高(P<0.05),SOD和LDH表达水平下降(P<0.05),MDA水平升高(P<0.05),线粒体膜电势下降(P<0.05),通透性增加(P<0.05),Nrf2表达水平升高(P<0.05),磷酸化水平增加(P<0.05)。与H_(2)O_(2)模型组比较,低剂量、中剂量和高剂量黄芪甲苷处理的ARPE-19细胞增殖活性明显升高(P<0.05),中剂量和高剂量黄芪甲苷处理的hTERT RPE-1细胞增殖活性明显升高(P<0.05)。ARPE-19细胞内ROS和脂质过氧化水平下降(均P<0.05),SOD和LDH表达水平升高(P<0.05),MDA水平下降(P<0.05),线粒体膜电势升高(P<0.05),通透性降低(P<0.05),Nrf2表达无明显变化(P>0.05),磷酸化水平增加(P<0.05)。结论黄芪甲苷缓解H_(2)O_(2)诱导的RPE氧化应激和线粒体功能损伤。
张艺曦张茜玥白一辰陆晓和
关键词:黄芪甲苷线粒体
贝那鲁肽预处理对高糖诱导视网膜色素上皮细胞损伤的影响
2024年
目的 探讨贝那鲁肽对高糖诱导视网膜色素上皮(adult retinal pigment epithelial-19,ARPE-19)细胞损伤的影响及可能机制。方法 ARPE-19细胞分为4组,对照组细胞于正常葡萄糖(5 mmol/L)中培养,高糖组ARPE-19细胞于30 mmol/L葡萄糖中培养,贝那鲁肽低、高浓度组:用贝那鲁肽(50 nmol/L、100 nmol/L)培养。MTT法观察细胞增殖率,流式细胞计数检测凋亡率,Hoechst33258染色观察细胞凋亡,DCFH-DA染色检测细胞氧化应激水平,Western blot检测磷酸化磷酸肌醇3激酶(phosphorylation phosphotylinosital 3 kinase, p-PI3K)以及磷酸化苏氨酸蛋白激酶(phosphorylated serine-threonine protein kinase, p-AKT)的表达。结果 MTT结果显示,贝那鲁肽处理后ARPE-19细胞增殖率升高,与高糖组比较差异具有统计学意义(P<0.05);高糖诱导ARPE-19细胞凋亡,贝那鲁肽抑制细胞凋亡,与高糖组比较差异有统计学意义(P<0.05);DCFH-DA染色结果显示,贝那鲁肽逆转了高糖介导的ARPE-19细胞中活性氧(reactive oxygen species, ROS)的升高;Western blot印迹法结果显示,贝那鲁肽干预后p-PI3K及p-AKT蛋白表达上调,与高糖组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 贝那鲁肽通过调节氧化应激和细胞凋亡来减轻高糖引起的ARPE-19细胞损伤。
矫梦瑶刘娟
关键词:高糖视网膜色素上皮细胞氧化应激
Notch1和自噬对高糖诱导下的视网膜色素上皮细胞的作用
2024年
目的观察高糖条件下Notch1与自噬之间的关系,并探讨Notch1抑制剂DAPT和自噬抑制剂3-MA对高糖培养的视网膜色素上皮细胞的影响。方法预实验选定25 mmol·L^(-1)葡萄糖作为ARPE-19细胞的高糖培养液,5 mmol·L^(-1)3-MA作为自噬抑制剂浓度。将体外培养的ARPE-19细胞随机分为对照组(添加5 mmol·L^(-1)葡萄糖培养48 h)、高糖组(添加25 mmol·L^(-1)葡萄糖培养48 h)、高糖+DAPT组(添加25 mmol·L^(-1)葡萄糖+40μmol·L^(-1)DAPT,40μmol·L^(-1)DAPT先处理2 h,然后更换25 mmol·L^(-1)葡萄糖处理48 h)及高糖+3-MA组(添加25 mmol·L^(-1)葡萄糖+5 mmol·L^(-1)3-MA,5 mmol·L^(-1)3-MA处理2 h,然后更换25 mmol·L^(-1)葡萄糖处理48 h)。采用透射电镜观察各组细胞超微结构;CCK-8和划痕实验检测各组细胞增殖和迁移情况;Western blot检测各组细胞Notch1和自噬相关蛋白LC3、Beclin1的蛋白表达情况;RT-PCR法检测各组细胞中Notch1、LC3、Beclin1的mRNA相对表达量。结果透射电子显微镜下对照组细胞结构正常,核呈圆形或卵圆形,自噬小体少量可见;高糖组细胞损伤略微明显,胞质不均且可见较多自噬溶酶体。与对照组相比,高糖组细胞增殖、迁移能力均上升,Notch1、LC3、Beclin1的mRNA和蛋白表达水平均增高(均为P<0.05);与高糖组相比,高糖+DAPT组细胞增殖、迁移能力均下降,Notch1、LC3、Beclin1的mRNA和蛋白表达水平均降低(均为P<0.05);与高糖组相比,高糖+3-MA组细胞增殖、迁移能力均下降,LC3、Beclin1的mRNA和蛋白表达水平均降低(均为P<0.05)。结论高糖可激活Notch1和自噬过程并促进ARPE-19细胞的增生,而Notch1抑制剂DAPT和自噬抑制剂3-MA在一定程度上可抑制自噬的进程,发挥抑制细胞增生的作用。
秦婷婷王苏涵张乐颖王娇娇宋宗明
关键词:自噬NOTCH信号通路人视网膜色素上皮细胞高糖
DRP1调控线粒体稳态对视网膜色素上皮细胞上皮-间充质转化的影响
2024年
目的探讨线粒体动力相关蛋白(DRP1)对视网膜色素上皮(ARPE-19)细胞上皮-间充质转化(EMT)进程的影响。方法构建H_(2)O_(2)干预ARPE-19细胞模型,将ARPE-19细胞分为3组,NG组:采用含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养细胞6 h;H_(2)O_(2)组:先采用650μmol·L^(-1)H_(2)O_(2)干预细胞,此后培养方式及时间与NG组相同;H_(2)O_(2)+Mdivi-1组:先采用10μmol·L^(-1)Mdivi-1处理ARPE-19细胞2 h,再给予650μmol·L^(-1)H_(2)O_(2)干预,此后培养方式及时间与NG组相同。Western blot检测各组细胞p-DRP-1/DRP1、E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、波型蛋白(Vimintin)及紧密连接蛋白(ZO-1)表达水平;线粒体红色荧光探针检测各组细胞线粒体形态;线粒体超氧化物红色荧光探针检测各组细胞线粒体活性氧(ROS)水平;JC-1染色试剂盒检测各组细胞线粒体膜电位;免疫荧光检测各组细胞中ZO-1表达水平。结果H_(2)O_(2)组细胞p-DRP-1/DRP1蛋白表达比值高于NG组,H_(2)O_(2)+Mdivi-1组细胞p-DRP-1/DRP1蛋白表达比值低于H_(2)O_(2)组,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。H_(2)O_(2)+Mdivi-1组细胞较H_(2)O_(2)组线粒体碎片化程度得到改善。H_(2)O_(2)组细胞线粒体ROS水平(4.42±0.29)与NG组(1.00±0.17)及H_(2)O_(2)+Mdivi-1组(2.15±0.18)比较,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。H_(2)O_(2)组细胞红/绿荧光强度比值(0.16±0.12)与NG组(1.00±0.09)及H_(2)O_(2)+Mdivi-1组(0.42±0.05)比较,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。H_(2)O_(2)组细胞上皮样标志物表达下降,间质样标志物表达上升,H_(2)O_(2)+Mdivi-1组细胞上皮样标志物表达上升,间质样标志物表达下降。各组细胞α-SMA、N-钙黏蛋白、E-钙黏蛋白、Vimintin及ZO-1相对表达量比较,H_(2)O_(2)组与NG组及H_(2)O_(2)+Mdivi-1组比较,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。ZO-1免疫荧光染色实验显示,H_(2)O_(2)+Mdivi-1组的细胞连接紧密程度优于H_(2)O_(2)组。结论DRP1�
汤中唐云骢
关键词:线粒体功能人视网膜色素上皮细胞上皮-间充质转化年龄相关性黄斑变性

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